張 娟，冷佳蔚，李水仙，趙 巖，祝清芬

（山東省食品藥品檢驗研究院·仿制藥研究與評價重點實驗室，山東 濟南 250101）

舒洛地特作為治療糖尿病腎病的新藥受到越來越多的關注［1］。舒洛地特是從豬腸黏膜提取精制的高度純化的天然糖胺聚糖，是由重復的二糖結構單元組成的帶有負電荷的長鏈大分子，二糖單元包含2 個改構糖，即N-乙酰半乳糖胺或 N-乙酰葡糖胺及糖醛酸［2-3］，具有抗凝、溶栓、抗炎免疫、調血脂和保護腎臟的作用。本研究中參照原國家食品藥品監(jiān)督管理（總）局《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》和《藥物非臨床研究質量管理規(guī)范》，對舒洛地特注射液進行了非臨床安全性試驗?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

BSA4000S 型電子天平（精度為 ±0.01 g）、BP211D 型電子天平（精度為 ± 0.01 mg），均購自德國 Sartorius 公司；TC10KA 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠，分辨率為 2 g）；3-18K 型臺式冷凍離心機（美國 Sigma 公司）；PURA22 型水浴鍋（優(yōu)萊博技術＜北京＞有限公司）；ASP200s 型全自動全封閉脫水機、EG1150 H ＆C 型包埋機、RM2245 型半自動輪轉式切片機、HI1210 型攤片機、HI1220 型烘片機、XL 型全自動染色機、CV5030 型全自動封片機，均購自德國Leica 公司；BX51 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 試藥

舒洛地特注射液1（供試品，國內某公司，批號為1704290，規(guī)格為每支 2 mL ∶600 LSU）；舒洛地特注射液 2（上市藥物對照，意大利Alfa Wassermann 公司，批號為14606，規(guī)格為每支 2 mL ∶600 LSU）；戊巴比妥鈉（西亞試劑，批號為05636）；氯化鈉注射液（山東齊都藥業(yè)有限公司，批號為1E17081803）；卵清蛋白（美國Sigma-Aldrich 公司，批號為SLBB5992V）；伊文思藍（上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠，F(xiàn)luka 公司進口分裝，批號為82-11-02）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動物

普通級新西蘭家兔 31 只，體質量 2.0 ～ 3.0 kg，雌性15 只，雄性16 只，購自濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心［動物生產許可證號為SCXK（魯）2015 0001］；普通級Hartley豚鼠60 只，體質量300 ～400 g，雌雄各半，購自濟南金豐實驗動物有限公司［動物生產許可證號為SCXK（魯）2014 0006］；均飼養(yǎng)于山東省食品藥品檢驗研究院普通環(huán)境動物實驗室［動物使用許可證號為SYXK（魯）20130012］。試驗方案實施前獲動物倫理委員會批準。標準條件飼養(yǎng)，溫度 20 ～ 26.0 ℃ ，相對濕度 40% ～70% ，日溫差≤3 ℃，照明12 h（明暗交替），每小時換氣次數(shù)不少于10 次。兔維持飼料、豚鼠生長繁殖飼料均購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司［飼料生產許可證號為京飼證（2014）06054，實驗動物（飼料）生產許可證號為 SCXK（京）2014-0010］。

1.4 方法［4-7］

1.4.1 劑量設計及依據(jù)

劑量及使用方法：按制劑說明書執(zhí)行，每日1 支，肌肉注射或靜脈滴注，連用15 ～20 d。

血管刺激性試驗和肌肉刺激性試驗：采用與臨床制劑相同的濃度給藥，即每日最大給藥量以60 kg成人體質量計算為10 LSU／kg，臨床使用最大濃度為300 LSU ／mL，人用最大劑量為 0.03 mL ／kg；人與家兔標準體質量等效劑量系數(shù)為3.08，家兔給藥劑量設定為 0.2 mL ／kg。

溶血性試驗、主動全身過敏試驗和被動皮膚過敏試驗：選用臨床使用最高濃度原液，作為供試品溶液。

1.4.2 試驗方法

血管刺激性試驗：取家兔15 只，雌性7 只、雄性8 只，按體質量隨機分為供試品組、上市藥物對照組和陰性對照組，各5 只。供試品組和上市藥物對照組家兔左側耳緣靜脈注射舒洛地特注射液0.2 mL／kg（原液濃度為300 LSU／mL），陰性對照組家兔相同部位注射等體積0.9%氯化鈉注射液；每日1 次，連續(xù)給藥7 d，給藥前稱定體質量。末次給藥72 h 時各組分別處死3 只家兔，14 d恢復期結束后各組分別處死2 只家兔。分別于注射部位近心端距離給藥部位約1 cm 處剪取耳緣靜脈組織1.0 ～4.0 cm，分 1.0 ～2.5 cm 和 2.5 ～4.0 cm 二段取材，觀察有無紅腫、淤血等肉眼可見的明顯刺激性表現(xiàn)；10%甲醛溶液固定，常規(guī)組織切片，并進行顯微鏡檢查。

肌肉刺激性試驗：取家兔15 只，雌性7 只、雄性8 只，按1.4.2 項下血管刺激性試驗中分組方法分為3 組。供試品組和上市藥物對照組家兔右側股四頭肌分別注射舒洛地特注射液0.2 mL／kg，陰性對照組家兔相同部位注射等體積0.9%氯化鈉注射液；每日1 次，連續(xù)給藥7 d，給藥前稱定體質量。末次給藥后48h 各組分別處死3 只家兔，14d 恢復期結束后各組分別處死2 只家兔。解剖取出股四頭肌，縱向切開，觀察注射部位有無充血、紅腫等刺激性癥狀。10%甲醛溶液固定，常規(guī)組織切片，并進行顯微鏡檢查。

溶血性試驗：于家兔心臟采血約10.0 mL，置裝有玻璃珠的三角瓶中，不停沿同一方向振搖10 min，去除纖維蛋白原后將其移入離心管中。加入0.9%氯化鈉注射液混勻，1 500 r／min 離心 15 min，取下層紅細胞，用0.9%氯化鈉注射液按上述方法洗滌3 次，至上清液無色透明為止。最后將所得紅細胞按體積用0.9%氯化鈉注射液制備成2%紅細胞懸液。取12 支試管并進行編號，其中 1 ～ 5 號管為供試品管，6 號管為陰性對照管，7 號管為陽性對照管，8 ～12 號管為上市藥物對照管。分別加入2 %紅細胞懸液、0.9%氯化鈉注射液、純化水、供試品和上市藥物對照（見表 1），混勻，于（37 ±0.5）℃水浴鍋中溫育，1 h 內每隔 15 min 觀察 1 次，1 h 后每隔 1 h觀察1 次，連續(xù)觀察3 h。肉眼觀察各管溶血與紅細胞凝聚情況，必要時進行顯微鏡檢查。

主動全身過敏試驗：取健康豚鼠24 只，按體質量隨機分為陰性對照組、陽性對照組、供試品組和上市藥物對照組，各6 只，雌雄各半。各組豚鼠分別腹腔注射0.5 mL 0.9% 氯化鈉注射液、0.4%卵清蛋白溶液、舒洛地特注射液原液、上市藥物對照原液進行致敏，隔日1 次，共致敏3 次。末次致敏后第14 天和第21 天，以2 倍致敏量于豚鼠后肢小隱靜脈注射相應藥液（1.0 mL）進行激發(fā)。激發(fā)即刻至激發(fā)后30 min，連續(xù)觀察3 h。觀察豚鼠反應及其反應出現(xiàn)、消失時間，并按全身致敏性評價標準［8］（見表 1）評判過敏反應。

表1 全身致敏性評價標準Tab.1 Evaluation criteria of systemic sensitization

被動皮膚過敏試驗［9-10］：取豚鼠 12 只，按體質量隨機分為陰性對照組、陽性對照組、供試品組和上市藥物對照組，各3 只。各組豚鼠分別腹腔注射相應溶液（同1.4.2 項下主動全身過敏試驗）0.5 mL，隔日1 次，共致敏3 次。末次致敏后第10 天腹主動脈取血，2 000 r／min離心10 min，分離血清，組內豚鼠血清合并備用；-20 ℃保存，2 周內使用。取豚鼠24 只，同法分組。各組豚鼠背部脫毛（3 cm×4 cm）。制備的抗血清用氯化鈉注射液按1∶2 稀釋，在脫毛區(qū)皮內注射相應的抗血清0.1mL，進行被動致敏；24 h 后，各組豚鼠后肢小隱靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原加等量1%伊文思藍共1.0 mL。激發(fā)30 min 后頸椎脫臼處死各組豚鼠，剪取背部皮膚，測量皮膚內層的斑點大小，直徑大于5 mm 者判定為陽性。不規(guī)則斑點的直徑計為長徑與短徑的均值。

2 結果

2.1 血管刺激性試驗

舒洛地特注射液耳緣靜脈注射第2 天后，供試品組001，004 號和上市藥物對照組007，009 號家兔注射部位出現(xiàn)少量瘀血，停藥48 h 后恢復正常。其他家兔試驗各階段一般臨床癥狀觀察未見異常。給藥前及恢復期給藥局部血管均清晰，未見血管擴張、收縮及淤血等癥狀，血管周圍組織亦無水腫等。末次給藥結束約72 h 和14 d恢復期結束后，肉眼觀察未見異常，顯微鏡下檢查顯示，供試品組和上市藥物對照組家兔的血管組織均未見明顯刺激性癥狀，與陰性對照組比較無明顯差異。詳見圖1。

2.2 肌肉刺激性試驗

供試品組001，003，005 號和上市藥物對照組006，008，010 號家兔給藥第2 天后注射部位出現(xiàn)充血和紅腫，停藥48 h 后恢復正常。其他家兔試驗各階段一般臨床癥狀觀察未見異常。大體病理學檢查顯示，末次給藥48 h 后及14 d 恢復期結束后，分別解剖取出給藥側股四頭肌，縱向切開。末次給藥結束48 h 后，肉眼可見供試品組 001，003，005 號和上市藥物對照 006，008，010 號家兔注射部位出現(xiàn)充血，供試品組和上市藥物對照組等級均為輕微刺激，陰性對照組等級為無刺激；恢復期觀察結束后肉眼觀察未見充血、紅腫等刺激性癥狀。組織病理學檢查顯示，末次給藥48 h 后，供試品組001，003，005 號和上市藥物對照組006，008，010 號家兔給藥側股四頭肌見出血，肌纖維變性、壞死，炎性細胞浸潤，間質巨噬細胞數(shù)目增多；陰性對照組011 號家兔給藥側股四頭肌見出血，肌纖維變性、壞死，伴炎性細胞浸潤，間質巨噬細胞數(shù)目增多，其他家兔給藥側股四頭肌未見明顯組織病理學改變?；謴推谟^察結束，供試品組、上市藥物對照組及陰性對照組家兔給藥側股四頭肌均未見明顯組織病理學改變。詳見圖2。

2.3 溶血性試驗

7 號管加入純化水后于15 min 出現(xiàn)澄明紅色，表明已經溶血；前幾個觀察時點，1 ～ 6 號管和 8 ～ 12 號管溶液呈混濁狀態(tài)，未見澄明紅色或棕紅色現(xiàn)象；后幾個觀察時點，1 ～6 號管和 8 ～12 號管紅細胞開始下沉，3 h后全部下沉，輕搖各管紅細胞散開。與6 號管比較，1 ～5 號管和 8 ～ 12 號管未見明顯異常，1 ～ 6 號管和 8 ～ 12號管均未見紅細胞凝聚現(xiàn)象。與7 號管比較，1 ～6 號管和8 ～12 號管有明顯差異。本品和上市藥物對照均無溶血和致紅細胞凝聚現(xiàn)象發(fā)生。加樣情況見表2。

2.4 主動全身過敏試驗

陽性對照組豚鼠激發(fā)后即刻出現(xiàn)不安寧（6／6）、撓鼻（6 ／6）、排尿（4 ／6）、步態(tài)不穩(wěn)（5 ／6）、喘息（2 ／6）、死亡（6／6）等明顯過敏反應，6 只豚鼠均在激發(fā)后5 min內死亡。按全身致敏性評價標準評判為極強陽性。豚鼠激發(fā)后一般狀況良好，未見明顯過敏反應癥狀。陰性對照組豚鼠激發(fā)后一般狀態(tài)良好，未見明顯過敏反應癥狀。與陰性對照組比較，供試品組和上市藥物對照組豚鼠均未見明顯差異，按全身致敏性評價標準評判為陰性。試驗期間各組豚鼠未見明顯異常，體質量增長良好，供試品組和上市藥物對照組與陰性對照組比較無明顯差異。

2.5 被動皮膚過敏試驗

表2 舒洛地特注射液溶血性試驗加樣表Tab.2 Hemolytic test of Sulodexide Injection

試驗期間，各組豚鼠一般狀態(tài)良好，未發(fā)現(xiàn)明顯異常。激發(fā)后30 min 處死豚鼠，剪取背部皮膚：陽性對照組豚鼠皮內注射抗血清處可見明顯藍斑，藍斑直徑分別為18，15，26，21，35 mm，均大于 5 mm，被動皮膚過敏反應發(fā)生率為100.00%。陰性對照組、供試品組、上市藥物對照組豚鼠激發(fā)后均未見明顯藍斑，過敏反應呈陰性。

3 討論

注射藥物的安全性評價是藥物臨床試驗的重要研究內容［11］。藥物的活性成分及其代謝物、輔料、有關物質及理化性質（如pH、滲透壓等）均有可能引起刺激性和／或過敏性和／或溶血性反應的發(fā)生［12］。本研究中對舒洛地特注射液進行了血管刺激性、肌肉刺激性、溶血性及過敏性觀察。舒洛地特注射液未見明顯的血管刺激性作用，也未見溶血和紅細胞凝集現(xiàn)象，對豚鼠的主動全身過敏反應和被動全身過敏反應均呈陰性。雖然舒洛地特注射液對家兔的股四頭肌在末次給藥48 h 后產生一定的肌肉刺激反應，但同其上市藥物對照的肌肉刺激性程度基本一致，均為輕度刺激，且均在停藥后逐漸恢復，恢復期結束后肌肉刺激性均已恢復。

綜上所述，舒洛地特注射液臨床前相關安全性評價試驗結果符合新藥申報要求，可供靜脈注射或肌肉注射，結合臨床使用，應注意監(jiān)測凝血酶原時間、凝血酶時間、活化部分凝血活酶時間、血漿纖維蛋白原、血漿抗凝血酶Ⅲ、D-二聚體等 6 項凝血指標［13］。