龔 崢，馬禮坤，葉 青，周俊嶺，孔祥勇

心肌纖維化是心肌因壓力超負(fù)荷、缺血損傷或代謝應(yīng)激引起的嚴(yán)重病理表現(xiàn)，是多種心臟疾病的最終進(jìn)展結(jié)果，其病理學(xué)特點(diǎn)是心肌間質(zhì)膠原的異常沉積，心肌條索化最終瘢痕形成。抑制心肌纖維化對(duì)改善心血管系統(tǒng)疾病的預(yù)后降低病死率具有重大意義。心肌纖維化的原因復(fù)雜，心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制不清楚。心肌纖維化是一個(gè)急需解決的臨床問題。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，控制生命活動(dòng)有重大意義。其中泛素羧基末端水解酶 L1(UCH-L1)是去泛素化酶家族的一個(gè)成員，UCH-L1在某些心臟疾病發(fā)生后的心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞內(nèi)都上調(diào)，所以UCH-L1上調(diào)可能在適應(yīng)不良心臟重塑和功能障礙中有重要的病理學(xué)意義。但是UCH-L1在心肌纖維化進(jìn)展中發(fā)揮什么樣的作用和具體的分子機(jī)制目前尚無研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6雄性小鼠40只，體質(zhì)量為(27±3)g，由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，SPF級(jí)別。

1.2 主要試劑

UCH-L1特異性阻滯劑LDN57444購自美國(guó)APExBIO生物公司，外源性PDGF-DD購自美國(guó) PeproThech公司，p-PDGFβ、PI3K、蛋白激酶B、p65兔單克隆抗體購自美國(guó)Bioworld公司。

1.3 方法

1.3.1

實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 隨機(jī)將24只小鼠分為4組，消毒皮膚，水合氯醛腹腔麻醉，皮下植入微量緩釋泵(Alzet膠囊緩釋泵)持續(xù)給藥，分別為sham組[0.9%氯化鈉溶液1 000 ng/(kg·min)]；Ang Ⅱ組[血管緊張素Ⅱ 1 000 ng/(kg·min)；LDN組(sham+LDN組)腹腔注射LDN57444，40 μg/(kg·d)]；Ang Ⅱ+LDN組[血管緊張素Ⅱ 1 000 ng/(kg·min)，腹腔注射LDN57444，40 μg/(kg·d)]。小鼠均清潔飼養(yǎng)14 d，每天稱重。

1.3.2

小鼠血壓及心功能檢測(cè) Visitech BP-2000尾袖系統(tǒng)隔天同一時(shí)間測(cè)定小鼠尾動(dòng)脈血壓并記錄。應(yīng)用M-mode超聲心動(dòng)儀測(cè)定小鼠心臟結(jié)構(gòu)和心功能變化，Vevo 2100系統(tǒng)行經(jīng)胸骨旁短軸超聲檢查，連續(xù)分析至少5～8個(gè)心動(dòng)周期并計(jì)算射血分?jǐn)?shù)，左室內(nèi)徑，左室后壁厚度，室間隔厚度等指標(biāo)。14 d后處死小鼠并取出心臟稱重，計(jì)算心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值。

1.3.3

天狼猩紅染色 第14天收集各組心臟組織用2%多聚甲醛在41 ℃下固定24 h，固定組織脫水，石蠟包埋，制作4 mm厚切片，然后苦味酸天狼猩紅膠原染色法染色，心肌間質(zhì)膠原面積與視野總面積的比值用于膠原沉積的定量測(cè)量。

1.3.4

原代心肌成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng) 將1～2 d小鼠心臟差速貼壁法分離純化CFs傳至第3代，分為：對(duì)照組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)、P組(細(xì)胞+培養(yǎng)基+20 ng/ml PDGF-DD)、 PL組(細(xì)胞+培養(yǎng)基+20 ng/ml PDGF-DD+40 μmol/L LDN57444)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的HG/DMEM，培養(yǎng)條件為5% CO、37 ℃。

1.3.5

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組PI3K、AKT、IκB 、UCH-L1、Ⅰ型膠原蛋白的mRNA表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CFs接種到6孔板內(nèi)，TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)RNA，對(duì)各組樣品目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.6

Western blot法檢測(cè)各組PDGFRβ、p-PDGFRβ、pPI3K、PI3K、pAKT、AKT、UCH-L1、pRb、Rb、Col Ⅰ的蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞分組后條件干預(yù)繼續(xù)孵育24 h，PL組加入LDN57444預(yù)處理2 h。使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解CFs，使用15%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉1 h。加入一抗(1 ∶500)4 ℃搖床過夜，洗滌3次，每次10 min。加入二抗(1 ∶1 000)室溫?fù)u床孵育2 h，洗滌3次，每次10 min。所有蛋白用ECL試劑盒進(jìn)行可視化。

1.3.7

染色質(zhì)免疫共沉淀 TNF-α處理心肌成纖維細(xì)胞1 h，用磷酸鹽緩沖的生理鹽水洗滌2次，在37 ℃下用1%甲醛交聯(lián)10 min，蛋白-DNA復(fù)合物用NF-κB p65抗體和正常兔IgG抗體免疫沉淀。純化后得到DNA進(jìn)行qRT-PCR分析。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中UCHL1抑制劑處理后改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心臟功能障礙

在灌注Ang Ⅱ前，各組小鼠收縮血壓約14.23 kPa。Ang Ⅱ組小鼠2周后收縮血壓增高，Ang Ⅱ+LDN組小鼠血壓相對(duì)于Ang Ⅱ組沒有變化。見圖1。通過超聲心動(dòng)圖測(cè)量結(jié)果顯示Ang Ⅱ灌注14 d后Ang Ⅱ組小鼠射血分?jǐn)?shù)(EF%)、室間隔厚度、左室后壁厚度和短軸縮短率(FS%)比Sham組增大，左室舒張內(nèi)徑比空白對(duì)照組減小，在Ang Ⅱ+LDN組的小鼠中相對(duì)于Ang Ⅱ組則降低，左室內(nèi)徑增大。見圖2。說明抑制UCHL1可逆轉(zhuǎn)Ang Ⅱ灌注誘導(dǎo)的小鼠心臟重構(gòu)。

圖1 各組小鼠尾監(jiān)測(cè)的收縮壓(n=6)

圖2 各組小鼠超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和功能變化A：各組小鼠心臟彩超；B：射血分?jǐn)?shù)；C：心臟質(zhì)量體質(zhì)量比；D：左心室短軸縮短指數(shù)；E：舒張期室間隔厚度；F：左室舒張期內(nèi)徑；G：舒張期左室后壁厚度；H：收縮期室間隔厚度；I：左室收縮期內(nèi)徑；J：收縮期左室后壁厚度；與Sham組比較：*P<0.05；與Sham+LDN組比較：#P<0.05

2.2 苦味酸天狼猩紅染色心肌間質(zhì)膠原測(cè)定

干預(yù)14 d后處死各組小鼠，取出心臟組織進(jìn)行天狼猩紅染色，心肌間質(zhì)內(nèi)膠原纖維呈紅色，正常心肌組織呈黃色。結(jié)果顯示Ang Ⅱ組心肌間質(zhì)膠原含量最多，與Sham組相比，Ang Ⅱ+LDN組左心室切片天狼猩紅染色顯示心肌纖維化程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=29.42，

P

<0.05)。見圖3。

圖3 天狼猩紅染色分析小鼠左心室血管周圍和心臟間質(zhì)纖維化變化與Sham組比較：**P<0.01；與Sham+LDN組比較：#P<0.05

2.3 心肌成纖維細(xì)胞的生理學(xué)特性

經(jīng)培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞90 min開始貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)24 h后CFs多呈梭形等形態(tài)，細(xì)胞排列緊密。培養(yǎng)至5代后，細(xì)胞逐漸開始衰老，細(xì)胞開始變大，增殖能力變?nèi)?，并可觀察到多核細(xì)胞。分離純化得到的CFs行波形蛋白免疫熒光染色陽性率>90%。見圖4。

圖4 光鏡下原代心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)及鑒定A：心肌成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)2代后熒光顯微鏡下觀察波形蛋白免疫熒光染色×200，vimentin蛋白呈現(xiàn)紅色熒光；B：細(xì)胞核DAPI染色×200；C：Merge

2.4 心肌成纖維細(xì)胞中各組熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

心肌成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)3代后，UCH-L1抑制劑LDN減輕PDGF-DD誘導(dǎo)的心肌纖維化，q-PCR進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示LDN組PI3K、AKT、IκB 、UCH-L1的mRNA水平相對(duì)于PDGF組沒有降低，LDN組的Col Ⅰ的mRNA水平相對(duì)于PDGF組降低(

F

=13.67，

P

<0.05)。見圖5。

圖5 各組PI3K、AKT、IκB、UCH-L1的mRNA相對(duì)表達(dá)水平1：Vehicle組；2：PDGF-DD組；3：PDGF-DD+LDN組; 與Vehicle組比較：**P<0.01；與PDGF-DD組比較：#P<0.05

2.5 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示LDN組UCH-L1的蛋白表達(dá)量相對(duì)于PDGF-DD組沒有變化，檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路中顯示蛋白水平和磷酸化水平相對(duì)于Vehicle組增高，其中LDN組p-PDGFRβ/PDGFRβ、pPI3K/PI3K、pRB/RB、Col I的蛋白表達(dá)量相對(duì)于PDGF-DD組降低(

P

<0.05)。見圖6。

圖6 各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平1：Vehicle組；2：PDGF-DD組；3：PDGF-DD+LDN組; 與Vehicle組比較：*P<0.05，**P<0.01；與PDGF-DD組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.6 心肌成纖維細(xì)胞中加入NF-κB活化特異性抑制劑后UCH-L1蛋白表達(dá)水平

體外培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞后給予20 ng/ml PDGF-DD誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入不同濃度的NF-κB活化特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC)，Western blot法檢測(cè)UCH-L1的蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=30.58，

P

<0.01)。見圖7。

圖7 在PDTC的不同濃度組UCH-L1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平與Vehicle組比較：**P<0.01

2.7 染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果

TNF-α處理心肌成纖維細(xì)胞1 h后，分別加入p65抗體和對(duì)照IgG抗體沉淀后行PCR定量分析，使用引物擴(kuò)增包含不同κB結(jié)合位點(diǎn)(KBS1和KBS2)的UCH-L1啟動(dòng)子DNA，通過實(shí)時(shí)PCR分析對(duì)共沉淀的DNA和相應(yīng)的輸入DNA進(jìn)行定量，NF-κB的結(jié)合序列KBS1和KBS2調(diào)控下游UCH-L1的表達(dá)。見圖8。

圖8 UCH-L1基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在NF-κB應(yīng)答原件A：UCH-L1基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)NF-κB結(jié)合序列(KBS1和KBS2)的位置被示出，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)顯示為線箭頭；B：TNF-α處理1 h的細(xì)胞中加入抗p65抗體沉淀和對(duì)照IgG抗體沉淀染色質(zhì)的定量PCR分析；與未用細(xì)胞因子處理的對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

心肌纖維化發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，心臟間質(zhì)中活化的心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，在多種細(xì)胞因子的作用下主要分泌Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，導(dǎo)致膠原沉積與分解失衡，與心肌纖維化進(jìn)展密切相關(guān)。UCH-L1在心血管疾病中的研究甚少，主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)，是調(diào)控細(xì)胞生物活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)劑，然而在心血管疾病發(fā)生后，心臟細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，膠原沉積修復(fù)組織，在心臟間質(zhì)細(xì)胞中可檢測(cè)到UCH-L1被上調(diào)，UCH-L1可能在調(diào)節(jié)適應(yīng)不良的心臟重塑和心臟肥大進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ撸詈蟀l(fā)展成心肌纖維化。該研究在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化模型中，給予UCH-L1的特異性抑制劑LDN57444后小鼠的心功能和心臟結(jié)構(gòu)改善，說明UCH-L1確實(shí)參與心肌纖維化的進(jìn)程，且LDN57444可有效改善心臟功能。在PDGF-DD誘導(dǎo)的小鼠心肌成纖維細(xì)胞纖維化中，通過qRT-PCR可檢測(cè)到UCH-L1的mRNA相對(duì)常規(guī)培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且給予UCH-L1的特異性抑制劑后，CFs中膠原蛋白分泌減少，纖維化指標(biāo)減少，這表明LDN57444確實(shí)有減輕心肌纖維化的作用。

NF-κB是炎癥和氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，直接調(diào)節(jié)各種心臟疾病狀態(tài)，包括心肌梗死、缺血/再灌注損傷、肥厚和充血性心力衰竭，過去積累的證據(jù)表明NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑在心臟炎癥中起重要作用。NF-κB對(duì)心肌肥厚有重要作用，而阻斷NF-κB可使心肌肥厚減輕。NF-κB的阻斷通過調(diào)節(jié)ECM蛋白阻止心肌肥厚，提示NF-κB在心臟纖維化中發(fā)揮重要作用。心肌纖維化過程中信號(hào)通路復(fù)雜，其中PDGFR-β/PI3K/Akt 信號(hào)通路是重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，心肌成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化與其密切相關(guān)。既往研究表明PI3K/Akt 信號(hào)通路在心臟心梗后促進(jìn)新生血管形成有重要作用。該研究表明通過PDGF-DD誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖分化，通過成纖維細(xì)胞膜上PDGFRβ受體，調(diào)節(jié)下游PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)軸，給予NF-κB活化抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC)后UCHL1的蛋白表達(dá)量減少。PDTC可通過抑制IκB磷酸化來抑制NF-κB的作用，降低下游細(xì)胞因子的表達(dá)。生物信息學(xué)分析顯示，UCH-L1的啟動(dòng)子區(qū)域具有公認(rèn)的NF-κB結(jié)合元件，染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示UCH-L1受上游-290 bp、-118 bp處啟動(dòng)子序列KBS1、KBS2調(diào)控，而KBS1、KBS2是NF-κB特異性結(jié)合的序列。

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤抑制蛋白(Rb蛋白)是一種真正的多功能蛋白，不僅具有潛在的腫瘤抑制功能，還是控制細(xì)胞增殖的重要環(huán)節(jié)。不同的刺激信號(hào)最終通過Rb磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)，進(jìn)而引導(dǎo)其控制的E2F轉(zhuǎn)錄因子的活性。該研究表明UCH-L1參與Rb蛋白的翻譯后調(diào)控來應(yīng)對(duì)血小板源生長(zhǎng)因子對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的增殖反應(yīng)。

該研究中PDGF-DD刺激心肌成纖維細(xì)胞后,UCH-L1的mRNA和蛋白表達(dá)增高，與對(duì)照組比較，下游膠原蛋白分泌增加，且信號(hào)軸通路上PDGFRβ、PI3K、AKT的mRNA和蛋白增加，說明PDGF-DD可促進(jìn)UCH-L1的表達(dá)。UCH-L1是DUBs家族中重要一員，該研究中提示UCH-L1是心肌炎癥向心肌纖維化轉(zhuǎn)變的重要紐帶，對(duì)于深入研究心肌炎癥和心肌纖維化之間的關(guān)系有著重要的意義，藥理學(xué)抑制劑(LDN 57444)具有特異抑制UCHL1的功能，能夠阻斷預(yù)先建立的心肌纖維化的進(jìn)一步發(fā)展。泛素系統(tǒng)在心臟疾病中的作用和肌成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能對(duì)心肌纖維化的研究有重大意義，UCH-L1的藥物靶向治療也為心肌纖維化的防治提供一個(gè)新的研究方向。