徐晶晶，胡 月，劉 文，宋雅嫻，彭亞琴，何國平，吳麗敏，汪 菁

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)(non-invasive prenatal testing, NIPT)的推廣應(yīng)用有效提高了染色體非整倍體異常的檢出率，降低了人口出生缺陷率。但NIPT的篩查也存在一定的局限性，既存在一定的漏篩風(fēng)險(xiǎn)，也存在一定比例NIPT結(jié)果與產(chǎn)前診斷染色體核型分析結(jié)果不一致的情況，這其中一個(gè)重要原因是染色體核型分析的分辨率為5～10 Mb導(dǎo)致染色體的微缺失微重復(fù)無法被檢測(cè)到。而隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，低深度全基因組測(cè)序技術(shù)(low-pass whole genome sequencing，Low-pass WGS)被逐漸應(yīng)用于產(chǎn)前診斷中，該項(xiàng)技術(shù)能檢測(cè)到100 Kb～5 Mb間的染色體微變異，能有效彌補(bǔ)染色體核型分析的不足。該研究對(duì)中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)165例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)單胎孕婦的產(chǎn)前診斷染色體核型分析結(jié)果和Low-pass WGS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了回顧性研究分析，并評(píng)估了Low-pass WGS對(duì)提高無創(chuàng)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的產(chǎn)前診斷異常檢出率的作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性選擇2018年1月—2019年8月間因無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)提示高風(fēng)險(xiǎn)來中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷、并且同時(shí)進(jìn)行染色體核型分析和Low-pass WGS檢測(cè)的165例單胎孕婦，年齡為20～35(31.3±5.5)歲，孕周為18～28周。該研究通過該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并且納入研究的所有孕婦均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1

羊膜腔穿刺術(shù) 對(duì)孕婦的羊膜腔穿刺由具有產(chǎn)前診斷資質(zhì)的醫(yī)師在B超引導(dǎo)下進(jìn)行，每個(gè)孕婦抽取3管羊水，每管10 ml，共30 ml，其中2管羊水進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，供染色體核型分析，剩下1管羊水進(jìn)行DNA提取，供Low-pass WGS檢測(cè)。

1.2.2

染色體核型分析 所有孕婦的羊水樣本進(jìn)行兩線細(xì)胞培養(yǎng)，每線接種10 ml羊水，培養(yǎng)至7 d左右進(jìn)行換液，1～2 d后在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)確定細(xì)胞收獲時(shí)間，而后利用枸櫞酸鈉低滲液消化法制片、吉姆薩染色顯帶、最后進(jìn)行核型分析。

1.2.3

Low-pass WGS檢測(cè) 每例孕婦羊水中取10 ml樣本送至華大基因公司完成Low-pass WGS檢測(cè)，其方法如下：使用DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)從羊水細(xì)胞中分離基因組DNA，使用50 ng基因組DNA作為起始模板，將DNA片段化至平均大小為150～200 bp，末端修復(fù)加A后用T4連接酶加上帶有特殊標(biāo)簽序列的接頭，PCR擴(kuò)增兩端帶有接頭的DNA片段，擴(kuò)增后濃度檢測(cè)，每個(gè)樣本取等量的DNA進(jìn)行混合，取混合后總量為160 ng的DNA進(jìn)行單鏈分離和環(huán)化反應(yīng)，最終得到單鏈環(huán)裝DNA文庫，在BGISEQ-500測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Burrows-Wheeler Aligner(Version0.7.7)比對(duì)軟件與人類參考基因組(GRCh37/hg19)進(jìn)行比對(duì)、分析，并通過UCSC、ClinVar、OMIM、ISCA、Decipher、Pubmed等數(shù)據(jù)庫檢索，綜合分析、評(píng)價(jià)所檢測(cè)到的CNV致病性。

1.2.4

隨訪 電話隨訪所有納入該研究的孕婦，對(duì)其妊娠結(jié)局及新生兒健康狀況進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果

2.1 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的染色體異常類型分布情況

165例孕婦中21三體高風(fēng)險(xiǎn)54例，占總例數(shù)的32.7%；18三體高風(fēng)險(xiǎn)14例，占總例數(shù)的8.5%；13三體6例，占總例數(shù)的3.6%；性染色體異常(性染色體數(shù)目偏多、偏少、片段缺失重復(fù))64例，占總例數(shù)的38.8%；其他染色體異常(除21、18、13、性染色體外的染色體數(shù)目異常及包括21、18、13號(hào)染色體在內(nèi)的片段缺失重復(fù))27例，占總例數(shù)的16.4%。

2.2 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的染色體核型結(jié)果分析

21三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中核型分析結(jié)果與NIPT一致的有44例，其中包括1例羅氏易位型21三體和1例21三體合并9號(hào)染色體倒位，陽性預(yù)測(cè)值為81.48%；18三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中核型分析結(jié)果與NIPT一致的有10例，陽性預(yù)測(cè)值為71.43%；13三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中核型分析結(jié)果與NIPT一致的有1例，為羅氏易位型13三體，陽性預(yù)測(cè)值為16.67%；性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中核型分析結(jié)果與NIPT一致的有22例，包括：6例47, XXY；3例47, XYY；3例47, XXX；2例45, X；1例46, X, i(X)(q10)；5例性染色體嵌合核型(45, X[10]/46, XX[52]；47, XXY[6]/46, XY[62]；45, X[13]/46, X, i(X)(q10)[47]；45, X[48]/46, XY[22]；45, X[39]/46, X, i(X)(q10)[8])，2例染色體結(jié)構(gòu)異常[46, XN, add(X)(p22.1)；46, XN, del(X)(p22.1)]，陽性預(yù)測(cè)值為34.38%；其他染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中檢出6例與NIPT結(jié)果一致，包括：46, XN, -13,+mar；46, XN, del(5)(p14)；46, XN, del(1)(q42)；46, XN, del(8)(p23)；46, XN, der(4)；47, XN,+22[5]/46, XN[69]；陽性預(yù)測(cè)值為22.22%。對(duì)165例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行核型分析共檢出83例異常核型，總異常檢出率為50.3%。見表1。

表1 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦產(chǎn)前診斷核型分析結(jié)果

2.3 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的Low-pass WGS結(jié)果分析

對(duì)無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷Low-pass WGS檢測(cè)，21三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中檢出44例陽性，均為21三體；18三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦檢出10例陽性，均為18三體；13三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦檢出1例陽性，為13三體；性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦檢出23例陽性，3例47, XXX；6例47, XXY；3例47, XYY；2例45, X；5例嵌合體(包括2例45, X和46, XX嵌合體；1例47, XXY和46, XY嵌合體；1例X染色體微重復(fù)嵌合體；1例Y染色體微缺失嵌合體)；3例X染色體微缺失；1例17號(hào)染色體微重復(fù)變異；其他類型染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)檢出10例陽性，1例2號(hào)染色體三體嵌合體；1例15號(hào)染色體三體嵌合體；1例16號(hào)染色體三體嵌合體；1例22號(hào)染色體三體嵌合體；6例已知致病或可疑致病性常染色體微缺失微重復(fù)變異。Low-pass WGS共檢出致病性和可疑致病性變異例數(shù)88例，臨床意義未明的變異(VOUS) 56例，總異常檢出率為53.3%。見表2。

表2 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦產(chǎn)前診斷Low-pass WGS結(jié)果

2.4 無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的染色體核型結(jié)果與Low-pass WGS結(jié)果的比較

與核型分析相比，Low-pass WGS檢出的21三體、18三體、13三體的例數(shù)相同，但在性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中檢出23例異常，在核型分析基礎(chǔ)上額外檢出1例，該病例的異常為17號(hào)染色體微重復(fù)；另有1例性染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦兩種檢測(cè)結(jié)果不太一致，Low-pass WGS檢測(cè)結(jié)果為45,X，核型分析結(jié)果為45,X[39]/46,X,i(X)(q10)[8]；在其他染色體異常高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中檢出10例異常，在核型分析基礎(chǔ)上額外檢出4例，分別為2號(hào)染色體三體嵌合、15號(hào)染色體三體嵌合、16號(hào)染色體三體嵌合、7號(hào)染色體微缺失。Low-pass WGS檢出異常的總例數(shù)比核型分析多出5例，總檢出率提高3%。見表3。核型分析與Low-pass WGS結(jié)果不一致的病例。見表4。

表3 核型分析與Low-pass WGS異常檢出率差異

表4 核型分析與Low-pass WGS結(jié)果不一致病例

2.5 隨訪結(jié)果

對(duì)納入該研究的165例孕婦的妊娠結(jié)局進(jìn)行了電話隨訪。88例致病性染色體異常的孕婦中，82例孕婦已選擇引產(chǎn)；6例孕婦在醫(yī)生充分告知后選擇正常分娩，其中1例為47,XN,+21，足月分娩，胎兒出生后已出現(xiàn)心臟異常；1例為47,XXX，足月剖宮產(chǎn)，胎兒出生后未見明顯異常；1例為47, XYY，足月剖宮產(chǎn)，胎兒出生后未見明顯異常；1例核型為47,XXY(6)/46,XY(62)，Low-pass WGS結(jié)果為X染色體重復(fù)嵌合11%，足月分娩，胎兒出生后未見明顯異常；1例核型正常，Low-pass WGS結(jié)果為15號(hào)染色體三體嵌合體，嵌合比例為10%，足月剖宮產(chǎn)，胎兒出生后未見明顯異常；1例核型正常，Low-pass WGS結(jié)果為46,XN,dup(17p12).seq[GRCh37/hg19](14,090,791-15,442,934)×3，足月分娩，胎兒出生后未見明顯異常。

3 討論

Lo et al研究表明孕婦外周血血漿中存在胎兒游離DNA，NIPT技術(shù)迅速發(fā)展，已在全球范圍內(nèi)成為一線染色體非整倍體變異篩查項(xiàng)目。該研究中21三體、18三體、及13三體的陽性預(yù)測(cè)值分別為81.48%、71.43%、16.67%，與以往報(bào)道基本一致。NIPT雖然對(duì)21三體、18三體和13三體的檢測(cè)有較高準(zhǔn)確性，但對(duì)其他染色體異常及染色體微缺失、微重復(fù)靈敏度不高，并且其假陽性和假陰性問題一直存在，主要原因包括限制性胎盤嵌合、雙胎中一胎凋亡、母體基因組拷貝數(shù)異常、母體惡性腫瘤、母血中胎兒DNA濃度低。因此在孕婦選擇該項(xiàng)檢測(cè)時(shí)，臨床醫(yī)生應(yīng)充分告知該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和局限性，重視其他的孕期檢查以防NIPT的漏篩。

近年來，Low-pass WGS在遺傳學(xué)診斷和產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用不斷深入。《低深度全基因組測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)》的發(fā)表為Low-pass WGS技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的規(guī)范應(yīng)用提供了指導(dǎo)建議。Wang et al報(bào)道了Low-pass WGS前瞻性臨床研究數(shù)據(jù)，對(duì)3 429例羊水樣本進(jìn)行分析，Low-pass WGS與核型分析相比，可額外檢出1%的明確致病性CNV。Wang et al對(duì)Low-pass WGS與芯片臨床應(yīng)用進(jìn)行了比較分析，與芯片相比，Low-pass WGS不僅對(duì)DNA起始量要求更低，擁有更高的檢測(cè)分辨率，并且對(duì)致病、可疑致病性CNV檢出率提高了1.7%，技術(shù)重復(fù)率從4.6%降低到了0.5%。該中心之前的報(bào)道提示對(duì)于高齡孕婦Low-pass WGS能在核型分析基礎(chǔ)上有效提高異常檢出率。該結(jié)果顯示Low-pass WGS相較于核型分析總體異常檢出率更高，其中兩種方法的21三體高風(fēng)險(xiǎn)、18三體高風(fēng)險(xiǎn)、13三體高風(fēng)險(xiǎn)的異常檢出率相同，但對(duì)性染色體異常和其他染色體異常的檢出率分別提高了1.55%和14.82%。在該研究中Low-pass WGS的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在能檢測(cè)出一些低比例嵌合體和染色體微缺失、微重復(fù)的病例。對(duì)于21、18、13三體高風(fēng)險(xiǎn)樣本，在該研究中Low-pass WGS未能體現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì)，可能原因在于一方面樣本量較少(74例)，另一方面21三體、18三體、13三體高風(fēng)險(xiǎn)的樣本總異常檢出率較高(74.32%)。

綜上所述，Low-pass WGS和核型分析聯(lián)合應(yīng)用于NIPT高風(fēng)險(xiǎn)人群中能有效提高染色體異常檢出率，尤其是針對(duì)染色體微缺失/微重復(fù)變異和低比例嵌合體的檢測(cè)，但尚不能通過該研究說明是否需對(duì)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)中21三體、18三體、13三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦采用Low-pass WGS，仍需更多的臨床數(shù)據(jù)結(jié)果分析進(jìn)行闡明。