王愛仙，王怡暄，張閩春，葉麗云，劉新銳，劉福陽(yáng)，趙俊敏，巫仁高，黃志龍，吳小平**

（1.福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 南平 354200；2.福建省武夷山市農(nóng)業(yè)局食用菌站，福建 武夷山 354300；3.福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福建 福州 350002；4.福建省食用菌技術(shù)推廣總站，福建 福州 350000）

靈芝 [Ganoderma lucidum(Lesyss ex Fr.)Karst]，隸屬于真菌門（Eumycota）擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱 （Hymenomycetes） 非褶菌目 （A-phyllophorales） 靈芝菌科 （Ganodermataceae） 靈芝屬（Ganoderma），又名神草、瑞草、神芝和萬(wàn)年蕈等[1]，有著悠久的歷史，是中國(guó)中醫(yī)藥寶庫(kù)中的一顆璀璨明珠。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)靈芝產(chǎn)量達(dá)到16.8萬(wàn)噸，比2017年產(chǎn)量增加22.13%，是世界上靈芝的主要生產(chǎn)和出口國(guó)[2]。靈芝含有豐富的生物活性物質(zhì)，如多糖、三萜、氨基酸、維生素、生物堿、甾醇類物質(zhì)等[3]，而多糖和三萜是其中的主要藥效成分，其含量可作為衡量靈芝質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)[4]。靈芝多糖具有降“三高”、抗癌、抗氧化、提高免疫力和增強(qiáng)體質(zhì)等功能[5-8]；靈芝三萜具有保肝排毒、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血脂、抑制腫瘤細(xì)胞、抗HIV病毒和抗炎等活性[9-10]。木屑與棉籽殼是靈芝栽培常用的主要原料，為探索木屑與棉籽殼的最優(yōu)配比的栽培配方，研究從靈芝子實(shí)體的產(chǎn)量、凈收益、多糖含量、三萜含量和水提物抗氧化活性等指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，從而篩選出綜合指標(biāo)好的優(yōu)良配方，為靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供積極的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

靈芝菌株T01由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。

1.2 出菇栽培

選用18 cm×35 cm聚乙烯塑料袋，不同靈芝栽培配方各輔料配比見表1。

表1 不同靈芝栽培配方各輔料配比Tab.1 Proportion of excipients in different Ganoderma lucidum cultivation formula

按照表1中的配方拌料裝袋，含水量60%，其中配方1為靈芝栽培常規(guī)配方，作為對(duì)照。每袋裝濕料1.25 kg，每個(gè)配方120袋，采用常規(guī)常壓滅菌，冷卻后在接種箱中接入原種，25℃黑暗培養(yǎng)菌絲，待菌絲滿袋完成后熟后移到出菇房開袋出芝。將菇房分為3區(qū)，每區(qū)每個(gè)配方40袋。設(shè)置出菇溫度為26℃～28℃，空氣濕度為85%～90%。當(dāng)靈芝芝蓋邊緣白色或黃色生長(zhǎng)圈消失轉(zhuǎn)為棕褐色，菌蓋開始革質(zhì)化，菌管層出紅褐色孢子時(shí)進(jìn)行采收，記錄每區(qū)每個(gè)配方采收靈芝鮮重。將新鮮靈芝放入60℃烘箱中烘干備用。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 多糖提取與檢測(cè)

靈芝多糖采用熱水浸提法進(jìn)行提取[11]。準(zhǔn)確稱取2 g靈芝子實(shí)體粉末，加20 mL蒸餾水90℃水浴2 h，6 000 r·min-1離心收集5 mL上清液。在樣品中加10 mL蒸餾水再重復(fù)提取1次，合并2次的提取液10 mL，加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉過夜。5 000 r·min-1下離心10 min，棄去上清液，所得沉淀用蒸餾水溶解并定容至50 mL。多糖檢測(cè)采用苯酚硫酸法[12]，每組3個(gè)重復(fù)。

1.3.2 三萜提取與檢測(cè)

靈芝三萜的提取參考葉麗云的方法[13]。準(zhǔn)確稱取2 g靈芝子實(shí)體粉末于100 mL三角瓶中，加入85%乙醇30 mL常溫浸提2 h后，超聲提取0.5 h。重復(fù)提取1次，合并2次提取液，用濾紙過濾收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃減壓蒸餾去除濾液中的乙醇，最后用甲醇定容至50 mL，每組3個(gè)重復(fù)。靈芝三萜含量采用香草醛-冰醋酸法檢測(cè)[14]，三萜圖譜相似度采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行檢測(cè)[15]。

1.3.3 靈芝水提物抗氧化活性的檢測(cè)

參照蔡夢(mèng)婷等[16]方法對(duì)靈芝進(jìn)行抗氧化活性研究。準(zhǔn)確稱取2 g靈芝子實(shí)體粉末，加20 mL蒸餾水90℃水浴2 h，6 000 r·min-1離心收集的上清液即為靈芝水提物。

DPPH自由基清除率的測(cè)定：吸取2.0 mL樣品溶液，加入2.0 mL的0.2 mmol·L-1DPPH溶液中，充分混勻后25℃避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值。設(shè)3個(gè)平行，求平均值。計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率（W，%），公式為：

式中：Aj空白組為以無水乙醇替代樣品的反應(yīng)體系的吸光值；Ai樣品組為添加樣品的反應(yīng)體系的吸光值；A0對(duì)照組為以無水乙醇替代DPPH的反應(yīng)體系的吸光值。

ABTS自由基清除率的測(cè)定：準(zhǔn)確配制7.0 mmol·L-1ABTS 溶液及 2.45 mmol·L-1過硫酸鉀水溶液，充分混勻，25℃避光靜置12 h～16 h后，即得ABTS+母液。將ABTS+母液用去離子水稀釋，使其在734 nm處的吸光值為0.70±0.023，并于30℃平衡30 min后，即得ABTS+工作液。吸取2.0 mL樣品溶液加入2.0 mLABTS+工作液，混勻后25℃避光放置20 min，于734 nm處測(cè)定吸光值。設(shè)3個(gè)平行，求平均值。計(jì)算樣品對(duì)ABTS自由基的清除率（M，%），公式為：

式中：A2空白組為以去離子水替代樣品的反應(yīng)體系的吸光值；A1樣品組為添加樣品的反應(yīng)體系的吸光值；A0對(duì)照組為以去離子水替代ABTS的反應(yīng)體系的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003和SPSS 19.0軟件。單袋產(chǎn)量以3個(gè)區(qū)的單袋產(chǎn)量的平均值表示。多糖、三萜和抗氧化活性樣品從每個(gè)區(qū)的40個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取3個(gè)，結(jié)果以x±σ表示。HPLC相似度分析利用軟件的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方對(duì)靈芝產(chǎn)量的影響

不同栽培配方對(duì)靈芝產(chǎn)量的影響見圖1。

圖1 不同配方栽培靈芝單袋產(chǎn)量Fig.1 Single bag yield of Ganoderma lucidum cultivated in different formulas

如圖1所示，以木屑為主的常規(guī)栽培配方1為對(duì)照，配方2、配方3、配方4、配方5的單袋產(chǎn)量得到顯著提高（P＜0.05），說明在輔料中加入棉籽殼有助于提高靈芝的產(chǎn)量。其中，配方3、配方4、配方5的產(chǎn)量與對(duì)照配方1相比達(dá)到極顯著水平（P＜0.01)，配方3、配方5單袋產(chǎn)量較高，分別比對(duì)照配方提高了33.49%、30.01%，其次是配方4，比對(duì)照配方提高了19.97%，說明同時(shí)用棉籽殼和木屑作為碳源栽培靈芝可顯著提高產(chǎn)量，且當(dāng)木屑與棉籽殼比為1∶1時(shí)效果最好。

2.2 不同配方對(duì)靈芝多糖與三萜含量的影響

不同栽培配方對(duì)靈芝子實(shí)體多糖和三萜含量的影響見表2。

表2 不同配方栽培靈芝子實(shí)體中多糖和三萜含量比較Tab.2 Contents of polysaccharides and triterpenoids in fruiting bodies of Ganoderma lucidum cultivated in different formulas

由表2所示，各配方中，配方2多糖含量為5.72 mg·g-1，極顯著高于對(duì)照配方 （P＜0.01），配方3、配方4、配方5之間多糖含量差異不顯著，約為（3.385±0.125） mg·g-1，且都極顯著低于對(duì)照配方1（4.61 mg·g-1，P＜0.01），說明在輔料中加入棉籽殼能有效提高靈芝子實(shí)體中多糖含量，但同時(shí)用棉籽殼和木屑不利于子實(shí)體多糖的積累。在三萜方面，配方4三萜含量是對(duì)照配方1的1.24倍。配方2、配方3三萜含量與對(duì)照配方相近，配方5三萜含量最低為4.90 mg·g-1。不同配方栽培靈芝子實(shí)體三萜高效液相圖譜見圖2，其圖譜相似度見表3。

由圖2、表3所示，利用高效液相檢測(cè)法所提取的三萜中靈芝酸的差異發(fā)現(xiàn)，不同配方靈芝酸圖譜相似度高，均在97%以上。由此可見，不同配方不改變?nèi)浦徐`芝酸種類。

表3 不同配方栽培靈芝子實(shí)體三萜高效液相圖譜相似度Tab.3 Similarity of triterpenoids in fruiting body of Ganoderma lucidum in different formulas

圖2 不同配方栽培靈芝子實(shí)體三萜高效液相圖譜Fig.2 High chromatogram of triterpenes from fruiting body of cultivated Ganoderma lucidum with different formulas

2.3 不同配方對(duì)靈芝水提物抗氧化活性的影響

以DPPH、ABTS自由基清除率為指標(biāo)，檢測(cè)不同配方栽培靈芝水提物抗氧化活性，結(jié)果見表4。

表4 不同配方栽培靈芝水提物對(duì)DPPH與ABTS自由基清除率Tab.4 DPPH and ABTS free radical scavenging rates of water extracts from Ganoderma lucidum cultivated in different formulas

由表4可知，不同配方栽培靈芝水提物均能一定程度消除自由基，其中在DPPH自由基清除率方面，配方2、配方4、配方5栽培的靈芝子實(shí)體抗氧化活性之間差異不顯著，但都顯著優(yōu)于對(duì)照配方1（P＜0.05）。在ABTS自由基清除率方面，配方3、配方4、配方5栽培的靈芝子實(shí)體抗氧化活性與對(duì)照相比相近，無顯著差異，而配方2對(duì)ABTS自由基清除活性最差為86.45%，顯著低于配方3、配方4。

3 討論與結(jié)論

靈芝是我國(guó)重要的藥用真菌，其藥理作用與靈芝次級(jí)代謝產(chǎn)物多糖和三萜等活性成分緊密相關(guān)。近年來研究表明生物體氧化代謝不斷產(chǎn)生的自由基，緊密參與生物機(jī)體老化與病變的發(fā)生過程，而靈芝提取物能一定程度上消除自由基。殳葉婷等[17]從鑒定分析、體外細(xì)胞、體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)等多個(gè)角度驗(yàn)證，靈芝多糖可以清除過多的自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，提高細(xì)胞活力從而對(duì)抗氧化損傷；蔡夢(mèng)婷等[16]研究靈芝孢子、子實(shí)體和菌絲體的抗氧化活性比較，發(fā)現(xiàn)菌絲體過氧化氫清除能力明顯優(yōu)于子實(shí)體和孢子，且活性部位主要集中在水提液醇沉分離的上清液；陳杰等[18]研究發(fā)現(xiàn)同種靈芝在不同產(chǎn)地的子實(shí)體其水提物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基的清除能力不同。本研究中的靈芝抗氧化活性比較分析中，不同木屑和棉籽殼的配比，其靈芝子實(shí)體的水提物均能消除部分自由基，但消除程度不同，配方5、配方2和配方4的DPPH自由基清除率顯著高于以木屑為主的常規(guī)栽培對(duì)照配方，配方3和配方4的ABTS自由基清除率顯著高于配方2。

靈芝是我國(guó)最早人工栽培的大型真菌，迄今已經(jīng)有2 000多年的栽培歷史[19]。人工栽培靈芝的方法可分為椴木栽培和代料栽培，代料栽培的主要原料有木屑、棉籽殼、玉米芯、甘蔗渣等。本研究選用靈芝栽培最常用的木屑和棉籽殼，設(shè)置不同的配比，結(jié)果表明，用木屑和棉籽殼作為輔助原料栽培靈芝可提高產(chǎn)量，且當(dāng)木屑與棉籽殼比為1∶1時(shí)效果最好。在輔料中加入棉籽殼能有效提高靈芝子實(shí)體中多糖含量，但同時(shí)用棉籽殼和木屑不利于子實(shí)體多糖的積累，不同配方不改變?nèi)浦徐`芝酸種類。從產(chǎn)量、品質(zhì)（多糖含量、三萜含量和水提物抗氧化活性等指標(biāo)） 綜合分析，得出配方4（木屑52%、棉籽殼26%、麥麩13%、玉米粉7%、蔗糖1%、石膏1%）是最佳的靈芝栽培配方。