陳利丁，劉云超，孔旭強，張琪輝，紀(jì)君儀，李 帆，孫淑靜**

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.古田縣食用菌研發(fā)中心，福建 寧德 352200）

銀耳（Tremella fuciformis），俗名白木耳，主要分布于亞熱帶地區(qū)，屬于中溫好氣性真菌[1]。銀耳生活史由擔(dān)孢子萌發(fā)開始至下一代擔(dān)孢子成熟結(jié)束[2]，擔(dān)孢子萌發(fā)產(chǎn)生萌發(fā)管或繼續(xù)無性分裂產(chǎn)生酵母狀分生孢子，萌發(fā)管延伸形成單核菌絲[3]，相鄰的2種單核菌絲在生長蔓延過程中互相結(jié)合形成雙核菌絲[2]；雙核菌絲繼續(xù)扭結(jié)形成白毛團，后逐漸膠質(zhì)化形成原基；原基在適宜條件下，繼續(xù)生長為子實體，子實體成熟后，會彈射大量的擔(dān)孢子，完成一個完整的生活史[2]。來源于子實體、菌絲體膠質(zhì)化產(chǎn)生的雙核酵母狀孢子（dikaryotic yeast-like spores from fruiting body and mycelia，F(xiàn)BMds） 是銀耳生活史的一個特殊形態(tài)，是銀耳在菌絲體階段、子實體階段由于在濕度過大（游離水過多）、溫度過高、機械碰撞等諸多不利環(huán)境下產(chǎn)生的一種應(yīng)激性反應(yīng)[2-3，6]，F(xiàn)BMds在一定條件下又可萌發(fā)形成菌絲，這在真菌學(xué)上稱為“二型現(xiàn)象”[4]。很多學(xué)者認(rèn)為FBMds是菌絲斷裂形成的節(jié)孢子[4-5]，鐘德義[6]認(rèn)為FBMds與菌絲的膠質(zhì)化程度有關(guān)，而不是簡單的菌絲斷裂。

通常情況下，銀耳一旦轉(zhuǎn)變?yōu)镕BMds，就很難再恢復(fù)為菌絲或子實體形態(tài)[8]。正是因為銀耳具有這個特性，在生產(chǎn)、保種過程中，一旦銀耳被發(fā)現(xiàn)形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，便遭廢棄。但酵母態(tài)的銀耳FBMds具有恢復(fù)為菌絲或子實體形態(tài)的潛能[3]，由FBMds萌發(fā)形成的菌絲具有極高的純度，若能穩(wěn)定傳代，將在育種、保種、基因功能研究等工作中發(fā)揮巨大優(yōu)勢。然而，目前如何使銀耳FBMds由酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z態(tài)的報道尚不多，而關(guān)于銀耳FBMds萌發(fā)效果的研究較為薄弱，萌發(fā)率不高，菌絲的產(chǎn)生帶有較大隨機性。在諸多環(huán)境因素中，香灰菌浸提液是影響銀耳FBMds萌發(fā)的重要因素[5]，同時在特定的固體培養(yǎng)基中，銀耳FBMds也可以產(chǎn)生銀耳菌絲[9]，但時間長，效率低。如何進一步提高銀耳FBMds的萌發(fā)率，使其在較短時間內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)殂y耳純菌絲，并可以繼續(xù)穩(wěn)定傳代，對研究銀耳二型態(tài)、銀耳菌種純化、新品種選育具有重要意義。在前人研究基礎(chǔ)上，以銀耳Tr21 FBMds菌株為材料，探究在固體培養(yǎng)條件下香灰菌浸提液、銀耳孢子發(fā)酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)的影響，以期得到具有較高萌發(fā)率的FBMds及能夠穩(wěn)定傳代的銀耳純菌絲。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

研究中所采用的8株銀耳孢子供試菌株、5株香灰菌供試菌株的名稱和來源見表1。

表1 供試菌株及來源Tab.1 Strains and sources

1.2 試劑與儀器設(shè)備

葡萄糖、KH2PO4購自西隴科學(xué)股份有限公司；麥芽糖、MgSO4·7H2O購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；（NH4）2SO4購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，以上試劑均為分析純；酵母粉、蛋白胨購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂購自北京索萊寶科技有限公司。

B-190TB正置生物顯微鏡，德國OPTIKA公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)震蕩儀，上海智誠分析儀器制造有限公司；XY-110MW含水量測定儀，常州幸運電子設(shè)備有限公司。

1.3 培養(yǎng)基配方

PDA加富培養(yǎng)基（1 L）：土豆200 g、葡萄糖20 g、酵母粉 3 g、蛋白胨 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO41.5 g，ddH2O 1 000 mL。

TSG 促萌發(fā)培養(yǎng)基 （1 L）：MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO41 g、KH2PO41.5 g、葡萄糖 10 g、麥芽糖10 g、瓊脂粉30 g，香灰菌浸提液400 mL，ddH2O定容 1 000 mL。

PDA加富固體培養(yǎng)基（1 L）：土豆200 g、葡萄糖 20 g、酵母粉 3 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，ddH2O 1 000 mL。

木屑培養(yǎng)基：木屑67%、麩皮30%、葡萄糖2%、石膏1%，料水比1∶1.3。

空白培養(yǎng)基（1 L）：麥芽糖10 g、葡萄糖10 g、MgSO4·7H2O 1 g、（NH4）2SO41 g、KH2PO41.5 g、瓊脂粉 30 g，補水至 1 000 mL[7，11]。

1.4 香灰菌浸提液與銀耳孢子發(fā)酵液的制備

1.4.1 香灰菌浸提液制備

用無菌接種鉤從試管中鉤取香灰菌接種塊至PDA加富固體培養(yǎng)基正中央，24℃活化7 d，用6 mm打孔器在長好的香灰菌上打孔，再用無菌接種鉤挑取1塊放在木屑培養(yǎng)基正中央，24℃培養(yǎng)30 d，調(diào)整培養(yǎng)基含水量為60%，準(zhǔn)確稱量300 g含有香灰菌的木屑培養(yǎng)基，加水1 500 mL沸水浴30 min，4層紗布過濾2次，加水定容至1 L。

1.4.2 銀耳孢子發(fā)酵液的制備

用無菌接種環(huán)從試管中刮取一環(huán)銀耳孢子并劃線至PDA加富固體培養(yǎng)基上，24℃活化7 d，將不同來源活化好的銀耳孢子接種到PDA加富培養(yǎng)基中，25℃搖床培養(yǎng)7 d，600 nm下測定發(fā)酵液OD值（光密度值），用無菌水將不同孢子發(fā)酵液OD值調(diào)整至基本一致，10 000 r·min-1離心5 min，取上清液，過濾除菌（濾膜孔徑0.45 μm）。

1.5 影響銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的因素研究

1.5.1 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響

制備香灰菌HTW01-5的浸提液，向TSG培養(yǎng)基及空白培養(yǎng)基中添加香灰菌浸提液，使TSG培養(yǎng)基香灰菌終濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%，制備成含有不同濃度香灰菌浸提液的萌發(fā)培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，保存?zhèn)溆?。將銀耳雙核酵母狀孢子Tr21 FBMds劃線至不同濃度的TSG培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，從第3天開始取樣鏡檢、計數(shù)，統(tǒng)計萌發(fā)為菌絲的FBMds數(shù)與未萌發(fā)的FBMds數(shù)，計算FBMds萌發(fā)率。萌發(fā)率（GR，%）計算公式為：

式中：A1為萌發(fā)的FBMds總數(shù)；A2為未萌發(fā)的FBMds總數(shù)。

1.5.2 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響

制備不同來源香灰菌的浸提液，向空白培養(yǎng)基中添加由1.5.1得出的最佳香灰菌浸提液添加濃度。制備含有不同來源香灰菌浸提液的TSG培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，保存?zhèn)溆?。將銀耳Tr21 FBMds劃線至培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，從第3天開始取樣、鏡檢并計算FBMds萌發(fā)率。

1.5.3 不同來源銀耳孢子發(fā)酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響

制備空白培養(yǎng)基，補水至800 mL，每個三角瓶（250 mL） 分裝80 mL，121℃滅菌20 min，保存?zhèn)溆?。加熱融化培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基溫度下降到60℃左右，每瓶加入20 mL不同來源的孢子發(fā)酵液，制備成終濃度為20%的孢子發(fā)酵液-萌發(fā)培養(yǎng)基（FSG培養(yǎng)基），直接倒平板備用。接種銀耳Tr21 FBMds，25℃靜置培養(yǎng)，從第3天開始取樣、鏡檢并統(tǒng)計FBMds萌發(fā)效果。

銀耳孢子發(fā)酵液的促萌發(fā)效果采用相對程度用0～1描述，對照為空白培養(yǎng)基添加培養(yǎng)孢子的PDA加富培養(yǎng)基，根據(jù)菌絲團大小及數(shù)量特征進行相關(guān)統(tǒng)計。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響、不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds的影響試驗中，萌發(fā)率統(tǒng)計取3個重復(fù)，單因素方差分析均采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響

不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響見圖1。

圖1 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響Fig.1 Effects of different concentration of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由圖1所示，香灰菌浸提液濃度對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響極大。由第3天Tr21 FBMds萌發(fā)率的平均值可知，在一定濃度范圍內(nèi)銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)率隨香灰菌浸提液濃度的增大而提高。其中含40%香灰菌浸提液的培養(yǎng)基FBMds萌發(fā)率最高，萌發(fā)率為30.12%。香灰菌浸提液的濃度超過40%后，F(xiàn)BMds萌發(fā)率無顯著提高。不同濃度香灰菌浸提液銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)情況見圖2。

圖2 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of different concentration of Annuloypoxylon stygium extracts on germination of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由圖2可知，從第5天開始，萌發(fā)的菌絲會聚集成菌絲團，無法通過震搖、吹打等方式將之分散開，對計數(shù)造成較大影響。隨著FBMds培養(yǎng)時間的延長，從顯微形態(tài)上看，萌發(fā)的FBMds會不斷聚集成菌絲團，且菌絲團會逐漸變大；從菌落形態(tài)看，平板菌落隨培養(yǎng)時間的延長，菌落逐漸變大，表層逐漸失水變干，菌落不斷收縮，最終呈溝壑狀，培養(yǎng)到第7天，部分平板菌落邊緣開始出現(xiàn)茸毛狀菌絲，再繼續(xù)培養(yǎng)，菌絲不會增多。顯微鏡下銀耳Tr21 FBMds的不同形態(tài)見圖3。

圖3 顯微鏡下銀耳Tr21 FBMds的不同形態(tài)Fig.3 Differentmorphology of Tremella fuciformis Tr21 FBMds under microscope

由圖3鏡檢結(jié)果可知，F(xiàn)BMds具有瓜子狀、橢圓狀和圓形3種形態(tài)。FBMds萌發(fā)時一頭伸出芽管，呈蝌蚪狀；隨后芽管逐漸延伸、變長甚至分叉，萌發(fā)的FBMds逐漸聚集成團，相鄰菌絲發(fā)生交合；分叉芽管、成團菌絲在顯微鏡下，可以觀察到明顯的鎖狀聯(lián)合。萌發(fā)后的銀耳Tr21 FBMds菌絲生長情況見圖4。

圖4 萌發(fā)后的銀耳Tr21FBMds在新的TSG培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of Tremella fuciformis Tr21 FBMds after germination on new TSG medium

由圖4可知，萌發(fā)后的FBMds菌落接種至新的TSG培養(yǎng)基后，開始大量芽殖，待長到一定大小后，菌落周圍產(chǎn)生白色致密菌絲。待菌落周圍菌絲長至一定面積后，對菌絲區(qū)域打孔并于新的TSG培養(yǎng)基上繼續(xù)傳代，可得到不含雙核酵母狀孢子的銀耳純菌絲。

2.2 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響

不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響見圖5。

圖5 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響Fig.5 Effects of different source of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

由圖5所示，不同來源的香灰菌對銀耳Tr21 FBMds的促萌發(fā)作用也不同。在香灰菌浸提液濃度不變的情況下（濃度40%），加入與銀耳Tr21伴生的原始香灰菌HTW01-5浸提液，銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)率最高，為30.34%，與不同來源、相同香灰菌菌種HTY01-SC、HT01-TH的浸提液對Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響無顯著差異。顯微鏡下其萌發(fā)情況見圖6。

由圖6可知，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，不同香灰菌浸提液均可促進FBMds萌發(fā)，且菌落形態(tài)均逐漸變大、變干燥、溝壑狀菌落愈發(fā)明顯。從第7天開始，Tr21 FBMds均能夠形成面積較大的菌絲團。

圖6 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)的影響Fig.6 Effects of different source of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds

2.3 不同來源銀耳孢子發(fā)酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響

銀耳孢子發(fā)酵液也是影響銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的重要因素之一。不同來源銀耳孢子發(fā)酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)的影響見圖7。

如圖7所示，不同來源的銀耳孢子發(fā)酵液均能在一定程度上提高銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)率。其中T30-CAS孢子發(fā)酵液的影響效果最為顯著，接下來依次為 Tr01、Tr21、T8225-CAS，均能夠形成大面積的菌絲團，見圖8。

圖7 不同來源銀耳孢子發(fā)酵液促FBMds萌發(fā)效果Fig.7 Effect of different sources fermentation broth of Tremella fuciformis spores on FBMds germination rate

圖8 不同F(xiàn)SG培養(yǎng)基中銀耳Tr21FBMds鏡檢圖與平板菌落形態(tài)Fig.8 Microscopic examination and plate colony morphology of Tr21 FBMds of Tremella fuciformis spores on different FSG medium

由圖8鏡檢結(jié)果可知，銀耳Tr21 FBMds在含TWY01-GP、T56-CAS孢子發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基中形成的菌絲團數(shù)量少、面積小、松散度高，且大部分是游離的芽管。比較香灰菌發(fā)酵液的促萌發(fā)效果，孢子發(fā)酵液中多為芽管形式存在，菌絲短，在含T30-CAS平板中有萌發(fā)程度高、菌絲團面積大的菌落，與其他平板比較，表面更加干燥，呈瘤狀突起。將促萌發(fā)過的銀耳Tr21 FBMds挑取較干燥部分并轉(zhuǎn)接至添加了不同銀耳孢子發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，菌落呈現(xiàn)出不同的形態(tài)見圖9。

圖9 FBMds在不同F(xiàn)SG培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.9 Colony morphology of FBMds on different FSG media

由圖9所示，在添加了TWW01-AX、TWY01-GP、T56-CAS孢子發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基上，部分位置的菌落外觀干燥，另一部分菌落依舊呈濕潤、飽滿的狀態(tài)；在含有促萌發(fā)效果較好的T30-CAS、Tr01、Tr21、T8225-CAS孢子發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基上，菌落呈半干的瘤狀；促萌發(fā)效果越好，菌落越干燥，菌落收縮越明顯。含有T30-CAS發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基上，僅有少部分平板菌落邊緣會產(chǎn)生纖弱的菌絲。由此可見，不同銀耳孢子發(fā)酵液促進FBMds萌發(fā)效果顯著低于香灰菌發(fā)酵液。

3 討論

當(dāng)前銀耳FBMds的產(chǎn)生對生產(chǎn)、保種而言均不利[8]。但是酵母態(tài)銀耳FBMds具有恢復(fù)為菌絲態(tài)的潛能，能極大地提高銀耳菌絲的純度，在育種、保種、基因功能研究等工作中均具有較大應(yīng)用前景。目前，常規(guī)的銀耳品種選育方法工作量大、過程煩瑣、育種效率低，而現(xiàn)代化的育種手段尚未取得實質(zhì)性進展[11]。但無論是原生質(zhì)體融合育種、誘變育種還是基因工程育種，其最終都要回歸到FBMds的研究上。如何使FBMds由酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z態(tài)，是當(dāng)前銀耳領(lǐng)域需要關(guān)注的重點，也是當(dāng)前銀耳領(lǐng)域向前發(fā)展的突破口。

二形態(tài)現(xiàn)象在許多真菌中普遍存在，尤以病原真菌如熱帶假絲酵母[12]、白念珠菌[13]等最為典型。銀耳作為二型性真菌，由于其酵母態(tài)細(xì)胞難萌發(fā)菌絲，相較于其他容易在二型態(tài)間轉(zhuǎn)變的真菌，基礎(chǔ)研究薄弱，未有突破性的進展[14]。銀耳FBMds的萌發(fā)由芽管開始，萌發(fā)的芽管會伸長、分叉，并與其他萌發(fā)的銀耳FBMds聚集交合，形成菌絲團，單個FBMds萌發(fā)后有鎖狀聯(lián)合，這與單倍體的擔(dān)孢子萌發(fā)的菌絲有本質(zhì)區(qū)別。

銀耳FBMds萌發(fā)與許多環(huán)境因素有關(guān)。劉娟等[5]認(rèn)為氮源、碳源、培養(yǎng)時間、pH、溫度和香灰菌的胞外液7種環(huán)境因素，均對銀耳TrJ38 FBMds向菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化有一定影響。其中過濾除菌后的香灰菌胞外液的添加對FBMds的形態(tài)轉(zhuǎn)化影響最大，能使菌絲型銀耳TrJ38的比率提高到9.89%，但認(rèn)為FBMds形態(tài)的轉(zhuǎn)變與香灰菌濃度無關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上進行改進，揭示了不同香灰菌菌種及濃度對銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)率的影響，香灰菌HTW01-5發(fā)酵液添加濃度為40%時，銀耳FBMds萌發(fā)率達30.34%，同時發(fā)現(xiàn)銀耳Tr21原始伴生的香灰菌HTW01-5促萌發(fā)作用最強。

在TSG培養(yǎng)基上，F(xiàn)BMds菌落由光滑、濕潤的酵母狀菌落逐漸失水、收縮、變干，最終形成干燥的溝壑狀菌落，部分菌落周邊長出少量肉眼可見的白色菌絲。FBMds菌落的干燥程度及收縮程度與FBMds萌發(fā)率息息相關(guān)，菌落表面越干燥、溝壑越明顯，F(xiàn)BMds萌發(fā)率越高、菌絲團越大。若將萌發(fā)的FBMds轉(zhuǎn)接至新的TSG培養(yǎng)基上，當(dāng)FBMds菌落長至一定大小后，其周邊長出大量肉眼可見的致密菌絲。除了香灰菌浸提液外，銀耳孢子發(fā)酵液也具有促進FBMds萌發(fā)的作用。香灰菌浸提液與銀耳孢子發(fā)酵液均可以顯著促進銀耳FBMds的萌發(fā)，但香灰菌浸提液的促萌發(fā)效果明顯優(yōu)于銀耳孢子發(fā)酵液，添加了香灰菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基所得的菌絲更加粗壯、濃密。

當(dāng)前銀耳育種主要是通過馴化野生種、不同來源銀耳與香灰菌的配對選育。銀耳雜交育種歷史上也僅報道過2例[15-16]。究其原因主要是銀耳純菌絲較難獲得，導(dǎo)致銀耳只能通過較為原始的方法進行育種。本研究優(yōu)化了銀耳FBMds的萌發(fā)條件，能在不需要大量重復(fù)的條件下幾乎能100%獲得銀耳純菌絲，且該銀耳純菌絲具有傳代能力，能繼續(xù)在TSG培養(yǎng)基上維持穩(wěn)定生長；此外，該方法得到的銀耳純菌絲能穩(wěn)定與香灰菌在木屑培養(yǎng)基上配對出耳。銀耳純菌絲的易獲得與穩(wěn)定出耳為以菌絲為基礎(chǔ)的雜交育種和以酵母態(tài)的FBMds為基礎(chǔ)的誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種等現(xiàn)代化育種方式奠定了基礎(chǔ)。同時，由FBMds萌發(fā)得到的菌絲相較于由子實體、白毛團得到的銀耳純菌絲純度高，對菌種純化工作具有極大意義。