陳利丁,劉云超,孔旭強,張琪輝,紀(jì)君儀,李 帆,孫淑靜**
(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 福州 350002;2.古田縣食用菌研發(fā)中心,福建 寧德 352200)
銀耳(Tremella fuciformis),俗名白木耳,主要分布于亞熱帶地區(qū),屬于中溫好氣性真菌[1]。銀耳生活史由擔(dān)孢子萌發(fā)開始至下一代擔(dān)孢子成熟結(jié)束[2],擔(dān)孢子萌發(fā)產(chǎn)生萌發(fā)管或繼續(xù)無性分裂產(chǎn)生酵母狀分生孢子,萌發(fā)管延伸形成單核菌絲[3],相鄰的2種單核菌絲在生長蔓延過程中互相結(jié)合形成雙核菌絲[2];雙核菌絲繼續(xù)扭結(jié)形成白毛團,后逐漸膠質(zhì)化形成原基;原基在適宜條件下,繼續(xù)生長為子實體,子實體成熟后,會彈射大量的擔(dān)孢子,完成一個完整的生活史[2]。來源于子實體、菌絲體膠質(zhì)化產(chǎn)生的雙核酵母狀孢子(dikaryotic yeast-like spores from fruiting body and mycelia,F(xiàn)BMds) 是銀耳生活史的一個特殊形態(tài),是銀耳在菌絲體階段、子實體階段由于在濕度過大(游離水過多)、溫度過高、機械碰撞等諸多不利環(huán)境下產(chǎn)生的一種應(yīng)激性反應(yīng)[2-3,6],F(xiàn)BMds在一定條件下又可萌發(fā)形成菌絲,這在真菌學(xué)上稱為“二型現(xiàn)象”[4]。很多學(xué)者認(rèn)為FBMds是菌絲斷裂形成的節(jié)孢子[4-5],鐘德義[6]認(rèn)為FBMds與菌絲的膠質(zhì)化程度有關(guān),而不是簡單的菌絲斷裂。
通常情況下,銀耳一旦轉(zhuǎn)變?yōu)镕BMds,就很難再恢復(fù)為菌絲或子實體形態(tài)[8]。正是因為銀耳具有這個特性,在生產(chǎn)、保種過程中,一旦銀耳被發(fā)現(xiàn)形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變,便遭廢棄。但酵母態(tài)的銀耳FBMds具有恢復(fù)為菌絲或子實體形態(tài)的潛能[3],由FBMds萌發(fā)形成的菌絲具有極高的純度,若能穩(wěn)定傳代,將在育種、保種、基因功能研究等工作中發(fā)揮巨大優(yōu)勢。然而,目前如何使銀耳FBMds由酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z態(tài)的報道尚不多,而關(guān)于銀耳FBMds萌發(fā)效果的研究較為薄弱,萌發(fā)率不高,菌絲的產(chǎn)生帶有較大隨機性。在諸多環(huán)境因素中,香灰菌浸提液是影響銀耳FBMds萌發(fā)的重要因素[5],同時在特定的固體培養(yǎng)基中,銀耳FBMds也可以產(chǎn)生銀耳菌絲[9],但時間長,效率低。如何進一步提高銀耳FBMds的萌發(fā)率,使其在較短時間內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)殂y耳純菌絲,并可以繼續(xù)穩(wěn)定傳代,對研究銀耳二型態(tài)、銀耳菌種純化、新品種選育具有重要意義。在前人研究基礎(chǔ)上,以銀耳Tr21 FBMds菌株為材料,探究在固體培養(yǎng)條件下香灰菌浸提液、銀耳孢子發(fā)酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)的影響,以期得到具有較高萌發(fā)率的FBMds及能夠穩(wěn)定傳代的銀耳純菌絲。
研究中所采用的8株銀耳孢子供試菌株、5株香灰菌供試菌株的名稱和來源見表1。
表1 供試菌株及來源Tab.1 Strains and sources
葡萄糖、KH2PO4購自西隴科學(xué)股份有限公司;麥芽糖、MgSO4·7H2O購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;(NH4)2SO4購自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司,以上試劑均為分析純;酵母粉、蛋白胨購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;瓊脂購自北京索萊寶科技有限公司。
B-190TB正置生物顯微鏡,德國OPTIKA公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱,上海博訊實業(yè)有限公司;ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)震蕩儀,上海智誠分析儀器制造有限公司;XY-110MW含水量測定儀,常州幸運電子設(shè)備有限公司。
PDA加富培養(yǎng)基(1 L):土豆200 g、葡萄糖20 g、酵母粉 3 g、蛋白胨 3 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、KH2PO41.5 g,ddH2O 1 000 mL。
TSG 促萌發(fā)培養(yǎng)基 (1 L):MgSO4·7H2O 1 g、(NH4)2SO41 g、KH2PO41.5 g、葡萄糖 10 g、麥芽糖10 g、瓊脂粉30 g,香灰菌浸提液400 mL,ddH2O定容 1 000 mL。
PDA加富固體培養(yǎng)基(1 L):土豆200 g、葡萄糖 20 g、酵母粉 3 g、蛋白胨 3 g、KH2PO41.5 g、MgSO4·7H2O 1.5 g,ddH2O 1 000 mL。
木屑培養(yǎng)基:木屑67%、麩皮30%、葡萄糖2%、石膏1%,料水比1∶1.3。
空白培養(yǎng)基(1 L):麥芽糖10 g、葡萄糖10 g、MgSO4·7H2O 1 g、(NH4)2SO41 g、KH2PO41.5 g、瓊脂粉 30 g,補水至 1 000 mL[7,11]。
1.4.1 香灰菌浸提液制備
用無菌接種鉤從試管中鉤取香灰菌接種塊至PDA加富固體培養(yǎng)基正中央,24℃活化7 d,用6 mm打孔器在長好的香灰菌上打孔,再用無菌接種鉤挑取1塊放在木屑培養(yǎng)基正中央,24℃培養(yǎng)30 d,調(diào)整培養(yǎng)基含水量為60%,準(zhǔn)確稱量300 g含有香灰菌的木屑培養(yǎng)基,加水1 500 mL沸水浴30 min,4層紗布過濾2次,加水定容至1 L。
1.4.2 銀耳孢子發(fā)酵液的制備
用無菌接種環(huán)從試管中刮取一環(huán)銀耳孢子并劃線至PDA加富固體培養(yǎng)基上,24℃活化7 d,將不同來源活化好的銀耳孢子接種到PDA加富培養(yǎng)基中,25℃搖床培養(yǎng)7 d,600 nm下測定發(fā)酵液OD值(光密度值),用無菌水將不同孢子發(fā)酵液OD值調(diào)整至基本一致,10 000 r·min-1離心5 min,取上清液,過濾除菌(濾膜孔徑0.45 μm)。
1.5.1 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響
制備香灰菌HTW01-5的浸提液,向TSG培養(yǎng)基及空白培養(yǎng)基中添加香灰菌浸提液,使TSG培養(yǎng)基香灰菌終濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%,制備成含有不同濃度香灰菌浸提液的萌發(fā)培養(yǎng)基,121℃滅菌20 min,保存?zhèn)溆?。將銀耳雙核酵母狀孢子Tr21 FBMds劃線至不同濃度的TSG培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng),從第3天開始取樣鏡檢、計數(shù),統(tǒng)計萌發(fā)為菌絲的FBMds數(shù)與未萌發(fā)的FBMds數(shù),計算FBMds萌發(fā)率。萌發(fā)率(GR,%)計算公式為:
式中:A1為萌發(fā)的FBMds總數(shù);A2為未萌發(fā)的FBMds總數(shù)。
1.5.2 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響
制備不同來源香灰菌的浸提液,向空白培養(yǎng)基中添加由1.5.1得出的最佳香灰菌浸提液添加濃度。制備含有不同來源香灰菌浸提液的TSG培養(yǎng)基,121℃滅菌20 min,保存?zhèn)溆?。將銀耳Tr21 FBMds劃線至培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng),從第3天開始取樣、鏡檢并計算FBMds萌發(fā)率。
1.5.3 不同來源銀耳孢子發(fā)酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響
制備空白培養(yǎng)基,補水至800 mL,每個三角瓶(250 mL) 分裝80 mL,121℃滅菌20 min,保存?zhèn)溆?。加熱融化培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基溫度下降到60℃左右,每瓶加入20 mL不同來源的孢子發(fā)酵液,制備成終濃度為20%的孢子發(fā)酵液-萌發(fā)培養(yǎng)基(FSG培養(yǎng)基),直接倒平板備用。接種銀耳Tr21 FBMds,25℃靜置培養(yǎng),從第3天開始取樣、鏡檢并統(tǒng)計FBMds萌發(fā)效果。
銀耳孢子發(fā)酵液的促萌發(fā)效果采用相對程度用0~1描述,對照為空白培養(yǎng)基添加培養(yǎng)孢子的PDA加富培養(yǎng)基,根據(jù)菌絲團大小及數(shù)量特征進行相關(guān)統(tǒng)計。
不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響、不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds的影響試驗中,萌發(fā)率統(tǒng)計取3個重復(fù),單因素方差分析均采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件處理。
不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響見圖1。
圖1 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響Fig.1 Effects of different concentration of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds
由圖1所示,香灰菌浸提液濃度對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響極大。由第3天Tr21 FBMds萌發(fā)率的平均值可知,在一定濃度范圍內(nèi)銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)率隨香灰菌浸提液濃度的增大而提高。其中含40%香灰菌浸提液的培養(yǎng)基FBMds萌發(fā)率最高,萌發(fā)率為30.12%。香灰菌浸提液的濃度超過40%后,F(xiàn)BMds萌發(fā)率無顯著提高。不同濃度香灰菌浸提液銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)情況見圖2。
圖2 不同濃度香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)的影響Fig.2 Effects of different concentration of Annuloypoxylon stygium extracts on germination of Tremella fuciformis Tr21 FBMds
由圖2可知,從第5天開始,萌發(fā)的菌絲會聚集成菌絲團,無法通過震搖、吹打等方式將之分散開,對計數(shù)造成較大影響。隨著FBMds培養(yǎng)時間的延長,從顯微形態(tài)上看,萌發(fā)的FBMds會不斷聚集成菌絲團,且菌絲團會逐漸變大;從菌落形態(tài)看,平板菌落隨培養(yǎng)時間的延長,菌落逐漸變大,表層逐漸失水變干,菌落不斷收縮,最終呈溝壑狀,培養(yǎng)到第7天,部分平板菌落邊緣開始出現(xiàn)茸毛狀菌絲,再繼續(xù)培養(yǎng),菌絲不會增多。顯微鏡下銀耳Tr21 FBMds的不同形態(tài)見圖3。
圖3 顯微鏡下銀耳Tr21 FBMds的不同形態(tài)Fig.3 Differentmorphology of Tremella fuciformis Tr21 FBMds under microscope
由圖3鏡檢結(jié)果可知,F(xiàn)BMds具有瓜子狀、橢圓狀和圓形3種形態(tài)。FBMds萌發(fā)時一頭伸出芽管,呈蝌蚪狀;隨后芽管逐漸延伸、變長甚至分叉,萌發(fā)的FBMds逐漸聚集成團,相鄰菌絲發(fā)生交合;分叉芽管、成團菌絲在顯微鏡下,可以觀察到明顯的鎖狀聯(lián)合。萌發(fā)后的銀耳Tr21 FBMds菌絲生長情況見圖4。
圖4 萌發(fā)后的銀耳Tr21FBMds在新的TSG培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.4 Colony morphology of Tremella fuciformis Tr21 FBMds after germination on new TSG medium
由圖4可知,萌發(fā)后的FBMds菌落接種至新的TSG培養(yǎng)基后,開始大量芽殖,待長到一定大小后,菌落周圍產(chǎn)生白色致密菌絲。待菌落周圍菌絲長至一定面積后,對菌絲區(qū)域打孔并于新的TSG培養(yǎng)基上繼續(xù)傳代,可得到不含雙核酵母狀孢子的銀耳純菌絲。
不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響見圖5。
圖5 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響Fig.5 Effects of different source of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds
由圖5所示,不同來源的香灰菌對銀耳Tr21 FBMds的促萌發(fā)作用也不同。在香灰菌浸提液濃度不變的情況下(濃度40%),加入與銀耳Tr21伴生的原始香灰菌HTW01-5浸提液,銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)率最高,為30.34%,與不同來源、相同香灰菌菌種HTY01-SC、HT01-TH的浸提液對Tr21 FBMds萌發(fā)率的影響無顯著差異。顯微鏡下其萌發(fā)情況見圖6。
由圖6可知,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,不同香灰菌浸提液均可促進FBMds萌發(fā),且菌落形態(tài)均逐漸變大、變干燥、溝壑狀菌落愈發(fā)明顯。從第7天開始,Tr21 FBMds均能夠形成面積較大的菌絲團。
圖6 不同來源香灰菌浸提液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)的影響Fig.6 Effects of different source of Annuloypoxylon stygium extracts on germination rate of Tremella fuciformis Tr21 FBMds
銀耳孢子發(fā)酵液也是影響銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)率的重要因素之一。不同來源銀耳孢子發(fā)酵液對銀耳Tr21 FBMds萌發(fā)的影響見圖7。
如圖7所示,不同來源的銀耳孢子發(fā)酵液均能在一定程度上提高銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)率。其中T30-CAS孢子發(fā)酵液的影響效果最為顯著,接下來依次為 Tr01、Tr21、T8225-CAS,均能夠形成大面積的菌絲團,見圖8。
圖7 不同來源銀耳孢子發(fā)酵液促FBMds萌發(fā)效果Fig.7 Effect of different sources fermentation broth of Tremella fuciformis spores on FBMds germination rate
圖8 不同F(xiàn)SG培養(yǎng)基中銀耳Tr21FBMds鏡檢圖與平板菌落形態(tài)Fig.8 Microscopic examination and plate colony morphology of Tr21 FBMds of Tremella fuciformis spores on different FSG medium
由圖8鏡檢結(jié)果可知,銀耳Tr21 FBMds在含TWY01-GP、T56-CAS孢子發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基中形成的菌絲團數(shù)量少、面積小、松散度高,且大部分是游離的芽管。比較香灰菌發(fā)酵液的促萌發(fā)效果,孢子發(fā)酵液中多為芽管形式存在,菌絲短,在含T30-CAS平板中有萌發(fā)程度高、菌絲團面積大的菌落,與其他平板比較,表面更加干燥,呈瘤狀突起。將促萌發(fā)過的銀耳Tr21 FBMds挑取較干燥部分并轉(zhuǎn)接至添加了不同銀耳孢子發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d,菌落呈現(xiàn)出不同的形態(tài)見圖9。
圖9 FBMds在不同F(xiàn)SG培養(yǎng)基上菌落形態(tài)Fig.9 Colony morphology of FBMds on different FSG media
由圖9所示,在添加了TWW01-AX、TWY01-GP、T56-CAS孢子發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基上,部分位置的菌落外觀干燥,另一部分菌落依舊呈濕潤、飽滿的狀態(tài);在含有促萌發(fā)效果較好的T30-CAS、Tr01、Tr21、T8225-CAS孢子發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基上,菌落呈半干的瘤狀;促萌發(fā)效果越好,菌落越干燥,菌落收縮越明顯。含有T30-CAS發(fā)酵液的FSG培養(yǎng)基上,僅有少部分平板菌落邊緣會產(chǎn)生纖弱的菌絲。由此可見,不同銀耳孢子發(fā)酵液促進FBMds萌發(fā)效果顯著低于香灰菌發(fā)酵液。
當(dāng)前銀耳FBMds的產(chǎn)生對生產(chǎn)、保種而言均不利[8]。但是酵母態(tài)銀耳FBMds具有恢復(fù)為菌絲態(tài)的潛能,能極大地提高銀耳菌絲的純度,在育種、保種、基因功能研究等工作中均具有較大應(yīng)用前景。目前,常規(guī)的銀耳品種選育方法工作量大、過程煩瑣、育種效率低,而現(xiàn)代化的育種手段尚未取得實質(zhì)性進展[11]。但無論是原生質(zhì)體融合育種、誘變育種還是基因工程育種,其最終都要回歸到FBMds的研究上。如何使FBMds由酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫z態(tài),是當(dāng)前銀耳領(lǐng)域需要關(guān)注的重點,也是當(dāng)前銀耳領(lǐng)域向前發(fā)展的突破口。
二形態(tài)現(xiàn)象在許多真菌中普遍存在,尤以病原真菌如熱帶假絲酵母[12]、白念珠菌[13]等最為典型。銀耳作為二型性真菌,由于其酵母態(tài)細(xì)胞難萌發(fā)菌絲,相較于其他容易在二型態(tài)間轉(zhuǎn)變的真菌,基礎(chǔ)研究薄弱,未有突破性的進展[14]。銀耳FBMds的萌發(fā)由芽管開始,萌發(fā)的芽管會伸長、分叉,并與其他萌發(fā)的銀耳FBMds聚集交合,形成菌絲團,單個FBMds萌發(fā)后有鎖狀聯(lián)合,這與單倍體的擔(dān)孢子萌發(fā)的菌絲有本質(zhì)區(qū)別。
銀耳FBMds萌發(fā)與許多環(huán)境因素有關(guān)。劉娟等[5]認(rèn)為氮源、碳源、培養(yǎng)時間、pH、溫度和香灰菌的胞外液7種環(huán)境因素,均對銀耳TrJ38 FBMds向菌絲形態(tài)轉(zhuǎn)化有一定影響。其中過濾除菌后的香灰菌胞外液的添加對FBMds的形態(tài)轉(zhuǎn)化影響最大,能使菌絲型銀耳TrJ38的比率提高到9.89%,但認(rèn)為FBMds形態(tài)的轉(zhuǎn)變與香灰菌濃度無關(guān)。本研究在此基礎(chǔ)上進行改進,揭示了不同香灰菌菌種及濃度對銀耳Tr21 FBMds的萌發(fā)率的影響,香灰菌HTW01-5發(fā)酵液添加濃度為40%時,銀耳FBMds萌發(fā)率達30.34%,同時發(fā)現(xiàn)銀耳Tr21原始伴生的香灰菌HTW01-5促萌發(fā)作用最強。
在TSG培養(yǎng)基上,F(xiàn)BMds菌落由光滑、濕潤的酵母狀菌落逐漸失水、收縮、變干,最終形成干燥的溝壑狀菌落,部分菌落周邊長出少量肉眼可見的白色菌絲。FBMds菌落的干燥程度及收縮程度與FBMds萌發(fā)率息息相關(guān),菌落表面越干燥、溝壑越明顯,F(xiàn)BMds萌發(fā)率越高、菌絲團越大。若將萌發(fā)的FBMds轉(zhuǎn)接至新的TSG培養(yǎng)基上,當(dāng)FBMds菌落長至一定大小后,其周邊長出大量肉眼可見的致密菌絲。除了香灰菌浸提液外,銀耳孢子發(fā)酵液也具有促進FBMds萌發(fā)的作用。香灰菌浸提液與銀耳孢子發(fā)酵液均可以顯著促進銀耳FBMds的萌發(fā),但香灰菌浸提液的促萌發(fā)效果明顯優(yōu)于銀耳孢子發(fā)酵液,添加了香灰菌發(fā)酵液的培養(yǎng)基所得的菌絲更加粗壯、濃密。
當(dāng)前銀耳育種主要是通過馴化野生種、不同來源銀耳與香灰菌的配對選育。銀耳雜交育種歷史上也僅報道過2例[15-16]。究其原因主要是銀耳純菌絲較難獲得,導(dǎo)致銀耳只能通過較為原始的方法進行育種。本研究優(yōu)化了銀耳FBMds的萌發(fā)條件,能在不需要大量重復(fù)的條件下幾乎能100%獲得銀耳純菌絲,且該銀耳純菌絲具有傳代能力,能繼續(xù)在TSG培養(yǎng)基上維持穩(wěn)定生長;此外,該方法得到的銀耳純菌絲能穩(wěn)定與香灰菌在木屑培養(yǎng)基上配對出耳。銀耳純菌絲的易獲得與穩(wěn)定出耳為以菌絲為基礎(chǔ)的雜交育種和以酵母態(tài)的FBMds為基礎(chǔ)的誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種等現(xiàn)代化育種方式奠定了基礎(chǔ)。同時,由FBMds萌發(fā)得到的菌絲相較于由子實體、白毛團得到的銀耳純菌絲純度高,對菌種純化工作具有極大意義。