盧凱 王香云 余紅

外泌體是一種細(xì)胞分泌的納米囊泡，可以用于 診斷和治療腫瘤、心腦血管疾病[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（microRNA，miR）參與了細(xì)胞增殖、凋亡、基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)過程，也參與了冠心病的發(fā)生、發(fā)展過程[2]。其中miR-210 是一種缺氧調(diào)控的miR[3]，其在缺氧環(huán)境下顯著升高，而冠心病的本質(zhì)即是心肌的缺血、缺氧。本文通過檢測冠心病患者血清外泌體中miR-210 的表達(dá)水平，探討其與冠心病病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016 年1 月至2018 年12 月湖州市第一人民醫(yī)院收治的冠心病患者102 例（冠心病組），冠心病的診斷符合WHO 關(guān)于《缺血性心臟病的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)》,且冠脈造影證實(shí)至少1 支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%；另擇同期在本院體檢、既往無心臟病史的健康者98 例為對照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并感染、其他系統(tǒng)疾病，惡性腫瘤，既往有心肌梗死、冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)或冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)史等。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號：2018ky038），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 Trizol 試劑（美國Invitrogen Life Technologies 公司，批號：15596026），miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國ABI 公司，批號：11754050），外泌體提取試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司，批號：4484450），SYBR Prime Script RT-PCR Kit （日 本TaKaRa 公司，批號：RR086A），熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司，型號：7500）。PCR 引物購自廣州銳博生物科技有限公司（批號：MQPS0000810-1-100）。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集 收集患者病史、體檢結(jié)果、實(shí)驗(yàn)室檢查及心電圖、心臟超聲等資料。所有對象實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均以清晨空腹外周靜脈血檢測結(jié)果為準(zhǔn)，包括甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、脂蛋白a 等；心臟超聲測量左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.3.2 血清外泌體提取及鑒定 外泌體提取按照試劑盒說明書操作，具體步驟：（1）所有血清樣本首先經(jīng)2 000 g 離心30 min，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片，收集上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中；（2）加入0.2 倍上清液體積的外泌體提取試劑到上清液中并混勻，并于2～8 ℃環(huán)境中孵育30 min；（3）室溫下10 000 g 離心10 min，棄去上清液，外泌體即沉淀在試管底部；（4）用適量PBS（100～500 μL）重懸，凍存于-80 ℃環(huán)境中備用。外泌體鑒定：通過蛋白印跡法檢測外泌體表面標(biāo)志物Alix 的表達(dá)，通過電鏡觀察外泌體的典型形態(tài)和粒徑大小。

1.3.3 外泌體miR-210 的提取和測定 采用Trizol提取外泌體總RNA 并監(jiān)測RNA 純度，以吸光度＞1.8 OD 值用于后續(xù)檢測。將提取的總RNA 使用miR cDNA 試劑盒，根據(jù)說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用線蟲cel-miR-39 作為內(nèi)參，應(yīng)用SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光技術(shù)定量檢測兩組對象血清miR-210 的相對表達(dá)量。采用相對Cq 法（ΔCq）分析miR-210 表達(dá)水平。

1.3.4 隨訪 通過對患者或家屬電話隨訪1 年，記錄患者發(fā)生主要不良心血管事件及存活狀況。主要不良心血管事件包括：急性冠脈綜合征、心力衰竭、心血管死亡以及復(fù)合終點(diǎn)。根據(jù)血清外泌體miR-210 表達(dá)均值將冠心病組分為高表達(dá)者和低表達(dá)者，分析血清外泌體miR-210 表達(dá)與患者主要不良心血管事件和死亡的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組對象一般資料比較 兩組對象除LDL-C、脂蛋白a 指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（均P＜0.05），其余指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組對象一般資料比較

2.2 血清外泌體的鑒定 見圖1。

由圖1 可見，在電鏡下觀察外泌體的形態(tài)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4]，囊泡直徑約100 nm，形態(tài)如杯口狀。

圖1 血清外泌體的鑒定（A：電鏡下外泌體的形態(tài)；B：蛋白印跡法檢測表面標(biāo)記蛋白Alix 的條帶圖）

2.3 兩組對象外泌體miR-210 表達(dá)水平比較 冠心病組外泌體miR-210 表達(dá)水平15.70±9.87，高于對照組8.54±6.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.24，P＜0.01）。

2.4 血清外泌體miR-210 與脂蛋白a、LDL-C 的相關(guān)性分析 將表1 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入相關(guān)性分析，結(jié)果顯示血清外泌體miR-210 與脂蛋白a、LDL-C 均呈正相關(guān)（r=0.657、0.624，均P＜0.01）。

2.5 血清外泌體miR-210 對冠心病的診斷價(jià)值血清外泌體miR-210 診斷冠心病的ROC 曲線下面積為0.852，在最佳截?cái)嗵庫`敏度為80.4%、特異度為78.7%，見圖2。

圖2 血清外泌體miR-210 診斷冠心病的ROC 曲線

2.6 血清外泌體miR-210 表達(dá)水平與患者主要不良心血管事件和死亡的關(guān)系 所有冠心病患者隨訪1 年，發(fā)生主要不良心血管事件36 例，死亡14 例。miR-210 高表達(dá)（miR-210≥15.7）者44 例，發(fā)生主要不良心血管事件20 例（45.45%），死亡10 例（22.72%）；低表達(dá)（miR-210＜15.7）者58 例，發(fā)生主要不良心血管事件16 例（27.59%），死亡4 例（6.9%），兩者主要心血管事件發(fā)生率及病死率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=66.0、88.0，均P＜0.01）。

3 討論

在我國心血管疾病的發(fā)病率及死亡率逐年增高。其中冠心病已經(jīng)成為人類的“殺手”之一，并呈年輕化趨勢，造成的社會負(fù)擔(dān)日益加重。冠狀動(dòng)脈急性缺血導(dǎo)致的心肌缺血缺氧的致死率極高，因此早期診斷及治療冠心病非常重要。

外泌體是細(xì)胞分泌的一種有膜結(jié)構(gòu)的納米囊泡，其直徑在100 nm 左右的，絕大多數(shù)細(xì)胞均可分泌外泌體[4]。在病理生理過程中，外泌體可能參與細(xì)胞-細(xì)胞之間的信號傳遞，其可以傳遞脂質(zhì)、蛋白、miR 等成分。近年來外泌體被廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期診斷、隨訪等[5]。miR 是一類由18～25 個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA，由于其具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能，使其在疾病的發(fā)生、發(fā)展中擁有不可忽視的重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR 參與冠心病、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[6-7]。且有研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死早期即可檢測到心肌特異性miR 的表達(dá)，提示miR 有希望成為新一代的診斷標(biāo)志物[8-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病組血清miR-210 水平顯著升高，相對表達(dá)水平為15.70±9.87，高于對照組8.54±6.21。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-210 是一種缺氧調(diào)控的microRNA，其普遍表達(dá)在缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞和組織中，并且miR-210 由缺氧誘導(dǎo)因子1-α 特異性調(diào)控[10]。miR-210 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)血管新生和DNA 損傷修復(fù)、改善線粒體代謝等[11-14]。本研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-210 水平與LDL-C、脂蛋白a 均呈正相關(guān)，提示其可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。為了評估對冠心病的診斷價(jià)值，本研究計(jì)算了外泌體miR-210 診斷冠心病的ROC曲線下面積為0.852，在最佳截?cái)嗵庫`敏度為80.4%、特異度為78.7%，可見外泌體miR-210 診斷冠心病具有較好的靈敏度和特異度。為了進(jìn)一步研究血清外泌體miR-210 水平與冠心病患者預(yù)后的關(guān)系，本研究對冠心病患者隨訪1 年，發(fā)現(xiàn)血清外泌體miR-210 高表達(dá)者主要不良心血管事件發(fā)生率及病死率明顯增加，提示血清外泌體miR-210 與冠心病患者預(yù)后相關(guān)，并且高表達(dá)者的預(yù)后不佳。

因此，臨床上可通過檢測血清外泌體miR-210的表達(dá)水平對冠心病進(jìn)行早期診斷、危險(xiǎn)分層及預(yù)后分析。但是由于本研究樣本量較少，未來仍需進(jìn)一步大樣本證實(shí)。