朱舟洋 翁雅雯 梁曉荷 黃周青 蔡雪黎 葉浡之

近年來，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）已逐漸成為人類死亡的首要病因。在心肌梗死過程中，由于持續(xù)的心肌缺血引發(fā)細胞死亡，最終導致心功能不全和惡性心律失常，甚至心臟性猝死[1-2]。因此，早期診斷和充分評估對AMI 患者的救治及預防心肌進一步損傷至關重要[3]。典型的心電圖表現(xiàn)和心肌壞死標志物如肌鈣蛋白是診斷AMI的關鍵指標[2，4]。但部分超急性期AMI 患者可以不伴有典型心電圖改變和肌鈣蛋白的升高[5]，這類患者在臨床中容易漏診。環(huán)狀RNA 是一類非編碼RNA，它具有閉環(huán)結構，不易被核酸外切酶降解[6-7]，且在人細胞中廣泛表達，在物種之間具有高度保守性[7-9]。這些結構特征提示，環(huán)狀RNA 在疾病診斷方面具有潛在的價值。本文旨在研究AMI 患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量以評估其與冠狀動脈病變嚴重程度的關系，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2018 年7 月至12 月在溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院行CT 冠脈造影（coronary angiography，CAG）的患者131 例，以胸痛為首診癥狀，其中男84 例，女47 例，年齡36～90（64.3±11.6）歲。根據患者癥狀、心電圖及CAG 結果分為AMI 組、不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）組和對照組。納入標準：（1）AMI 組、UAP 組納入標準：CAG 提示至少1 支主要血管狹窄≥50%，且分別由2 位不同術者根據美國心臟協(xié)會/ 美國心臟病學學會（AHA/ACC）指南冠狀動脈數(shù)的分類確認；AMI 指持續(xù)胸痛＞20 min，心電圖示相鄰導聯(lián)ST 段抬高/壓低、伴心肌酶學/肌鈣蛋白升高；UAP 指靜息或低運動負荷下胸痛持續(xù)時間＞20 min，且近期（1 個月內）出現(xiàn)發(fā)作頻率、持續(xù)時間改變及癥狀加重等，但不伴有肌鈣蛋白I 或T 升高；（2）對照組納入標準：既往無冠心病或卒中病史；心電圖、心臟超聲檢查無異常，無急慢性肝腎疾病；CAG 提示陰性。排除標準：血流動力學不穩(wěn)定者或心源性休克患者；嚴重肝功能衰竭，丙氨酸轉氨酶≥正常3 倍以上者；明顯自身免疫性疾??；未得到控制的甲狀腺功能不全；惡性腫瘤；活動期的全身感染；孕婦、哺乳者；近3 個月內正在參加其他臨床試驗者；精神疾病患者；拒絕參加本研究患者。該研究方案通過本院醫(yī)學倫理委員會批準（批準文號：YS2020 第108 號），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 生化指標檢測 入院時收集患者各項檢查數(shù)據及既往病史。在行CAG 后立即采集患者靜脈血，收集到乙二胺四乙酸管中，進行密度梯度離心，采用貝克曼庫爾特AU5800 分析儀及其相關的試劑（美國貝克曼庫爾特公司）檢測血脂、血糖、肝腎功能等常規(guī)生化指標。

1.2.2 CAG 檢測 由至少2 位具有豐富臨床經驗的介入科醫(yī)生對患者進行多體位手術造影，然后由至少2 位高年資心血管醫(yī)師根據CAG 結果仔細判讀，評定冠狀動脈每支病變血管的狹窄程度。根據CAG 結果分為AMI 組（具有典型胸痛且肌鈣蛋白I升高，CAG 提示存在冠狀動脈閉塞）72 例、UAP 組（有胸痛癥狀但心電圖不典型，無肌鈣蛋白I 升高，CAG 提示存在冠狀動脈狹窄）28 例、對照組（有胸痛癥狀，CAG 陰性）31 例。

1.2.3 環(huán)狀RNA-0007478 表達量檢測 從患者外周血單個核細胞提取mRNA，經逆轉錄形成cDNA，利用qRT-PCR 檢測環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量。GAPDH 上游引物：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′；GAPDH 下游引物：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3；環(huán)狀RNA-0007478 上游引物：5′-ATACATCTGCTGCCTACATTCC-3′ ；環(huán) 狀 RNA-0007478 下游引物：5′-AGTCCCCAAGTACCAAGTGC-3′。采用美國Applied Biosystems 公司7300Plus儀器進行熒光定量PCR 反應，加入對應的cDNA 樣本，每孔10 μL 的反應體系，PCR 循環(huán)程序設置為：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30s，72 ℃延長30 s，重復40 個循環(huán)。以人GAPDH 為外參，circRNA_0007478的相對表達量用2-ΔΔCt表示，ΔCt=Ct 目的基因-Ct外參基因。ΔΔCt=ΔCt 實驗組-ΔCt 對照組。確定患者血清單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量。根據AHA/ACC 關于冠狀動脈病變部位的標準[10]，AMI 組患者進一步分為近端血管病變者和遠端血管病變者。根據心肌梗死發(fā)病持續(xù)時間，將AMI 組患者分為0～4 h 者（10 例），＜4～8 h 者（34例），＜8～12 h 者（16 例），＜12～24 h 者（8 例），＜24～72 h 者（4 例）。分析并比較不同部位血管病變者及不同心肌梗死發(fā)病持續(xù)時間者血清單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量。

1.2.4 Gensini 評分 Gensini 評分是根據冠狀動脈狹窄程度來確定冠狀動脈疾病的嚴重程度[11]，狹窄程度評估以動脈阻塞的25%劃分，且包括冠狀動脈的解剖位置。所有患者均按照標準技術進行定期CAG，至少有2 位經驗豐富的介入心臟病專家對冠狀動脈病變的嚴重程度進行評估。根據血管狹窄程度，無狹窄計0 分，1%～25%計1 分，26%～50%計2分，51%～75%計4 分，76%～90%計6 分，91%～99%計16 分，100%計32 分。根據病變血管的位置分配不同的權重系數(shù)。左主干計5 分，左前降支近端病變計2.5 分，左前降支中段病變計1.5 分，左前降支遠端病變計1 分，左旋支中遠段病變計1 分，右冠狀動脈病變計1 分，小支病變計0.5 分。各血管分支Gensini 總分=狹窄程度評分×體重指數(shù)[12]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Empower 軟件（X & Y Solutions Inc，Boston，MA，USA;http://www.stats.com）和R 軟件（http://www.Rproject.orgAQ3）。正態(tài)分布的計量資料以 表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以百分率表示，多組比較采用χ2檢驗，組間兩兩比較采用χ2分割法。環(huán)狀RNA-0007478 表達量與Gensini 評分的關系采用Pearson 相關。繪制ROC 曲線，評估環(huán)狀RNA-0007478 預測AMI 的價值。采用多元線性回歸分析患者冠狀動脈狹窄嚴重程度的獨立危險因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

表1 3 組患者一般資料比較

2.1 3 組患者一般資料比較 見表1。

由表1 可見，3 組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。AMI 組吸煙比例、白細胞、超敏C 反應蛋白、低密度脂蛋白膽固醇、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、腦鈉肽、肌鈣蛋白I、左心室射血分數(shù)均較對照組和UAP 組升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

2.2 3 組患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478的相對表達量比較 見圖1。

由圖1 可見，3 組患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。AMI 組環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量高于UAP 組和對照組（均P＜0.05），后兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 AMI 組不同心肌梗死發(fā)病持續(xù)時間者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量比較 見圖2。

圖1 3 組患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量比較（與UAP 組比較，*P＜0.05；與對照組比較，**P＜0.01）

圖2 AMI 組不同心肌梗死發(fā)病持續(xù)時間者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量比較（與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖2 可見，AMI 組中心肌梗死發(fā)病持續(xù)時間0～4 h、＜4～8 h 者，環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量較對照組差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），＜8～12 h、＜12～24 h 者環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量均高于對照組（均P＜0.05），24 h 后，環(huán)狀RNA-0007478 表達量下降，低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 冠心病危險因素對環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量的影響 見圖3。

由圖3 可見，環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量在非高血壓患者和高血壓患者、非高脂血癥患者和高血脂癥患者、非糖尿病患者和糖尿病患者、非吸煙患者及吸煙患者中比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.5 環(huán)狀RNA-0007478 對AMI 預測價值的ROC曲線分析 見圖4。

圖4 環(huán)狀RNA-0007478 對AMI 預測價值的ROC 曲線分析

圖3 冠心病危險因素對患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量的影響

由圖4 可見，環(huán)狀RNA-0007478 預測AMI 的曲線下面積為0.866，靈敏度為0.7966，特異度為0.7778，約登指數(shù)為0.5744，截斷值為0.0005，這提示環(huán)狀RNA-0007478 可作為AMI 發(fā)生的獨立預測因子。

2.6 環(huán)狀RNA-0007478 與Gensini 評分的相關性分析 見圖5。

由圖5 可見，AMI 組患者中，近端血管閉塞者49 例（68%），遠端血管閉塞者23 例（32%）。近端血管病變患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478相對表達量為0.0008176±0.0000413，高于遠端血管病變患者0.0005454±0.0000431（P＜0.01）。環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量與Gensini 評分呈正相關（r=0.493，P＜0.01）。

2.7 Gensini 評分的相關性分析及Gensini 評分與環(huán)狀RNA-0007478 的多元線性分析 見表2、3。

圖5 患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量與Gensini 評分的相關性分析散點圖

表2 Gensini 評分的相關性分析

表3 環(huán)狀RNA-0007478 與Gensini 評分的多元線性分析

由表2 可見，Gensini 評分與心肌梗死危險因素的相關性分析中，吸煙史、低密度脂蛋白膽固醇、肌鈣蛋白I、超敏C 反應蛋白、白細胞、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶水平均與Gensini 評分有相關性（均P＜0.05）。由表3 可見，在環(huán)狀RNA-0007478 與Gensini 評分的多元線性回歸中，模型分析調整了表2 中與Gensini 評分相關的因素，結果顯示環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量與Gensini 積分具有獨立相關性（β=5.27，95%CI：3.14～7.40，P＜0.01）。

3 討論

AMI 發(fā)生的主要病理生理機制是冠狀動脈粥樣斑塊破裂，而巨噬細胞在動脈粥樣硬化斑塊進展中扮演重要角色。筆者前期通過環(huán)狀RNA 芯片發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA-0007478 在氧化修飾的低密度脂蛋白刺激的巨噬細胞中表達顯著上調（芯片數(shù)據詳見GSE107522），而環(huán)狀RNA-0007478 與AMI 之間的關系鮮有報道。

冠狀動脈長時間閉塞可導致心肌壞死，在冠狀動脈閉塞早期及時診治可有效挽救受損的心肌，改善AMI 患者近期和遠期的預后。目前，急診經皮冠狀動脈介入術和急診冠狀動脈旁路移植術的開展，有效降低了心肌梗死患者的死亡率[13]。但臨床上仍有部分AMI 患者，特別是老年人，常常不能準確地描述胸痛癥狀，若存在心電圖表現(xiàn)不典型，肌鈣蛋白未明顯或僅輕度升高，在未行CAG 的情況下需對AMI 進行鑒別診斷，同時這類患者又是極高?；颊?，早期診斷對提高這類患者的生存率至關重要[14]。此外，由于部分醫(yī)院條件不足限制了臨床醫(yī)師對冠脈動脈狹窄疾病嚴重程度的判斷。因此，如果能找到一種新的生物標志物既能在早期診斷AMI，又能反映冠狀動脈狹窄的嚴重程度，這將對患者的診療帶來便利。本研究發(fā)現(xiàn)在AMI 患者中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量明顯升高，是AMI 發(fā)生的獨立預測因子，且環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量與Gensini 評分呈正相關，即與AMI 患者冠狀動脈病變的嚴重程度相關，有望成為用于診斷早期心肌梗死的生物學標志物。

研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA 的異常表達與疾病的發(fā)生有關[15-17]。如環(huán)狀RNA 在急性腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護作用[18]。Cui 等[19]研究表明，在外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-103636 的表達在診斷重度抑郁癥方面具有潛在價值。環(huán)狀RNA-CDR1as 作為微小RNA-7 的分子海綿，參與心肌梗死的發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，AMI 患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量高于UAP 組和對照組，而后兩組相比差異無統(tǒng)計學意義，這表明環(huán)狀RNA-0007478 在AMI 患者中出現(xiàn)高表達。此外，本研究將心肌梗死發(fā)生時間分成5 個時間段，環(huán)狀RNA-0007478 的表達量在心肌梗死發(fā)生的＜8～24 h表達升高，但在＜24～72 h 下降至正常水平，提示AMI 患者的環(huán)狀RNA-0007478 相對表達量具有時間依賴性。ROC 曲線分析顯示，環(huán)狀RNA-0007478作為AMI 的標志物具有良好的診斷價值，并且具有較好的靈敏度和特異度。

患者的臨床特征，如性別、吸煙、肥胖和糖尿病，是AMI 的危險因素，并可能影響其發(fā)病率[21]。眾所周知，性別是心血管疾病的一個重要危險因素。由于身體激素的差異，男性通常比女性更早出現(xiàn)心血管疾病[22]。在本研究中，冠心病的危險因素如高血壓、高血脂、糖尿病以及吸煙等并不影響環(huán)狀RNA-0007478 的表達，這使得環(huán)狀RNA-0007478的表達量有助于反映AMI 的病情。通過相關性分析顯示環(huán)狀RNA-0007478 與患者Gensini 評分呈正相關（r=0.493，P＜0.01），表明環(huán)狀RNA-0007478 表達量與冠狀動脈狹窄的嚴重程度存在相關性。為了糾正可能影響Gensini 評分的混雜因素，對性別、吸煙史、超敏C 反應蛋白、低密度脂蛋白膽固醇和白細胞進行了多元線性回歸分析，結果顯示環(huán)狀RNA-0007478 與Gensini 評分具有獨立相關性（P＜0.01）。在校正其他影響因素后，環(huán)狀RNA-0007478表達上調1 個劑量單位，患者Gensini 評分提高5.27 分，故環(huán)狀RNA-0007478 可作為預測冠狀動脈病變嚴重程度的獨立危險因素，其在冠狀動脈病變的進程中發(fā)揮一定的作用。此外，本研究未納入非冠狀動脈閉塞的AMI 患者，因此本文的研究結論僅適用于冠狀動脈閉塞的AMI 患者。

綜上所述，冠狀動脈閉塞的AMI 患者外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 的相對表達量升高，呈時間依賴性，是冠狀動脈閉塞AMI 發(fā)生的獨立預測因子。且環(huán)狀RNA-0007478 表達與高血壓、高血脂、糖尿病及吸煙無關，而與Gensini 評分呈正相關，反映了AMI 患者冠狀動脈狹窄病變的嚴重程度。外周血單個核細胞中環(huán)狀RNA-0007478 有望成為一種新的、可靠的診斷AMI 和預測冠狀動脈病變嚴重程度的生物標志物。