劉衛(wèi)東，馮燕，惠文佳，王春，司軍強(qiáng)，高峰

1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化科，新疆烏魯木齊830001；

2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科，新疆烏魯木齊830001；

3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，新疆石河子832000

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)的發(fā)病與腸黏膜屏障缺陷、遺傳易感性、微生物環(huán)境不平衡等多因素共同作用下的腸道免疫功能紊亂有關(guān)[1]。機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障與生物屏障的相互作用構(gòu)成了腸道黏膜屏障。其中機(jī)械屏障主要有縫隙連接、緊密連接和黏附連接共同參與，而縫隙連接蛋白對(duì)黏膜屏障具有調(diào)節(jié)作用[2]。縫隙連接通道的基本單位是連接蛋白(connexin，Cx)，連接蛋白在不同的組織和器官中的表達(dá)具有特異性，結(jié)腸上表達(dá)的有Cx26、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx36、Cx40、Cx43、Cx45[3-4]。其中比較重要的縫隙連接蛋白就是Cx43，研究表明它具有腫瘤抑制的特性[5]。Cx32敲除的小鼠中，通過(guò)X射線照射發(fā)現(xiàn)小鼠總體腫瘤負(fù)荷明顯增加，說(shuō)明連接蛋白表達(dá)的缺失與腫瘤發(fā)生增加有關(guān)[6]。目前，縫隙連接蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎中的研究較少，且連接蛋白可能作為潰瘍性結(jié)腸炎潛在的預(yù)測(cè)標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。因此，本研究通過(guò)分析Cx43和Cx32在UC大鼠模型中表達(dá)和分布差異，初步探討縫隙連接蛋白在UC中的表達(dá)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量約200 g。大鼠來(lái)源于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為DNBS(2,4-Dinitrobenzene sulfonic acid)誘導(dǎo)模型組15只和對(duì)照組15只。本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)了新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(KY2018011817)。

1.1.2 主要試劑與儀器其中有二硝基苯磺酸(2,4-Dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS)(Sigma公司)；小鼠單克隆Cx32抗體(Abcam公司)；兔多克隆Cx43抗體(Abcam公司)；鼠抗β-actin抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；RNeasy Mini Kit試劑盒(Qiagen公司)；總蛋白提取試劑盒(Qiagen公司)；CFX96TOuch熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；LSM510激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss公司)，雙垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNBS誘導(dǎo)的UC大鼠模型及驗(yàn)證大鼠禁食24 h，用指尖輕輕按壓動(dòng)物的肛門，去除可能出現(xiàn)在遠(yuǎn)端結(jié)腸的糞便。模型組采用七氟烷麻醉誘導(dǎo)并維持，使用直徑為0.1 cm、長(zhǎng)度為10 cm的聚乙烯導(dǎo)管，隨后使用50%乙醇溶解的DNBS灌注誘導(dǎo)結(jié)腸炎，注射劑量為100 mg/kg。模型期間給大鼠正常喂食并飲水使用8%的蔗糖溶液。造模4 d后，采用七氟烷麻醉，頸椎脫臼處死，迅速取出大鼠結(jié)腸組織并處理干凈。截取部分大鼠結(jié)腸組織使用4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行固定，通過(guò)免疫組化驗(yàn)證UC大鼠模型。

1.2.2 Cx32和Cx43 mRNA在結(jié)腸組織的表達(dá)大鼠結(jié)腸組織采用RNeasyMini Kit試劑盒提取結(jié)腸組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系置于實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。Cx32、Cx43和β-actin的擴(kuò)增引物見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)采用β-actin作為內(nèi)參，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，通過(guò)計(jì)算出每個(gè)樣品2-△△Ct，得出Cx32、Cx43 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因引物序列

1.2.3 Cx32和Cx43在結(jié)腸組織的分布和表達(dá)處理后的大鼠結(jié)腸組織置于含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液內(nèi)固定48 h，冰凍切片，使用3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后分別加入Cx32和Cx43特異性抗體4℃過(guò)夜。次日加入FITC標(biāo)記相關(guān)二抗，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行避光操作，使用熒光顯微鏡進(jìn)行分析蛋白的表達(dá)水平和位置分布；Western blot檢測(cè)按照試劑盒操作步驟進(jìn)行組織蛋白提取，用BCA法測(cè)定全蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，23 V電轉(zhuǎn)43 min，5%牛奶封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)后，棄去封閉液，分別加入Cx32和Cx43一抗，振蕩孵育4℃過(guò)夜。次日取再與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相關(guān)二抗室溫孵育，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒處理、顯影、定影，呈像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，組間兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型的建立及驗(yàn)證UC大鼠模型組中均出現(xiàn)懶動(dòng)、拱背、厭食、消瘦、皮毛光澤度下降、大便次數(shù)增多、部分出現(xiàn)黏液血便。UC造模前和3 d后比較體質(zhì)量由(212.5±7.3)g下降至(202.5±10.6)g，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.41，P＞0.05)。每天記錄實(shí)驗(yàn)大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分，即DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+大便性狀分?jǐn)?shù)+便血情況分?jǐn)?shù))/3。UC模型組1 d、2 d、3 d的DAI評(píng)分分別為(0.79±0.17)分、(1.29±0.27)分、(2.13±0.25)分，呈上升趨勢(shì)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.1，P＜0.01)。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)腸組織表現(xiàn)為黏膜充血水腫甚至糜爛。大鼠結(jié)腸組織形態(tài)的病理改變見(jiàn)圖1。對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜可見(jiàn)單層柱狀上皮細(xì)胞排列整齊，腸腺清晰，吸收細(xì)胞與杯狀細(xì)胞的形態(tài)正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DNBS誘導(dǎo)的大鼠模型組結(jié)腸黏膜肌層，杯狀細(xì)胞出現(xiàn)缺失，隱窩形態(tài)不規(guī)則，大部分可見(jiàn)潰瘍面，隱窩膿腫形成，嚴(yán)重者可見(jiàn)中性粒細(xì)胞破壞至平滑肌層。

圖1 對(duì)照組和UC模型組中結(jié)腸組織病理形態(tài)變化

2.2 UC組大鼠中Cx32和Cx43mRNA表達(dá)水平比較實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Cx32和Cx43 mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示(圖2)：UC模型組中的Cx32和Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組分別提高2.3倍和3.4倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.4、12.3，P＜0.05)。

圖2 UC模型組結(jié)腸組織中Cx32和Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.3 UC模型大鼠中Cx32和Cx43的表達(dá)和分布比較免疫定光分析Cx32和Cx43在UC模型組中的平均熒光密度分別為115.2±4.6、104.6±7.2，高于對(duì)照組的106.3±5.7、59.5±4.8，僅Cx43的表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-17.8，P＜0.01)。Cx32和Cx43的熒光在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜均有分布，UC模型組中Cx32和Cx43的定位顯著向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(圖3)；Western blot結(jié)果顯示(圖4)，UC模型組中Cx32蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高1.2倍，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高1.6倍，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.2，P＜0.01)。

圖3 UC組和對(duì)照組結(jié)腸組織中Cx32和Cx43的表達(dá)及分布(200×)

圖4 結(jié)腸組織中Cx32和Cx43相對(duì)表達(dá)量

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎屬慢性非特異性炎癥性疾病，病情反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，伴隨多種腸外表現(xiàn)，且具有癌變的傾向，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[7]。目前，潰瘍性結(jié)腸炎是慢性腹瀉的主要病因，其發(fā)病機(jī)制可能與腸黏膜屏障缺陷、遺傳易感人群在腸道持續(xù)感染以及環(huán)境改變等多因素作用下發(fā)生腸道免疫功能紊亂有關(guān)[8]。以細(xì)胞間縫隙連接為途徑進(jìn)行細(xì)胞間直接的信息交流與腸黏膜屏障功能的缺陷和免疫功能紊亂密切相關(guān)。免疫組化提示大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞丟失，隱窩膿腫形成。腸黏膜屏障是UC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要因素，是調(diào)控機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、生成炎癥介質(zhì)的重要器官。縫隙連接蛋白在多種炎癥及腫瘤發(fā)展的不同階段存在表達(dá)水平的差異，并能與體內(nèi)細(xì)胞周期或腫瘤形成相關(guān)的蛋白發(fā)生相互作用，參與免疫調(diào)節(jié)[9]。

縫隙連接通道是由相鄰的兩個(gè)細(xì)胞通過(guò)特殊的細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)相互作用連接形成的通路，構(gòu)成縫隙連接的基本單位是連接蛋白(connexin，Cx)。目前，在人類中已發(fā)現(xiàn)超過(guò)20種的連接蛋白，細(xì)胞膜上每6個(gè)連接蛋白亞基聚合形成一個(gè)半通道，細(xì)胞間的兩個(gè)半通道形成兼容且有功能的縫隙連接通道是通過(guò)半通道亞基中的氫鍵相互錨定形成的[10]?？p隙連接通道可以允許相對(duì)分子質(zhì)量小于1 kD的小分子物質(zhì)自由通過(guò)，包括ATP、cAMP、IP3和離子。細(xì)胞之間通過(guò)縫隙連接蛋白形成一個(gè)低電阻通道進(jìn)行信息、能量和物質(zhì)的交換，參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號(hào)傳遞的電偶聯(lián)，對(duì)細(xì)胞和組織的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、增殖和分化等生理過(guò)程具有重要的調(diào)節(jié)作用[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎大鼠中Cx32和Cx43蛋白和mRNA的表達(dá)增高，縫隙連接蛋白表達(dá)的增高可能參與炎癥反應(yīng)過(guò)程，尤其是Cx43可能具有重要的調(diào)節(jié)作用。眾多結(jié)果表明，縫隙連接在結(jié)直腸腫瘤的疾病進(jìn)展中具有著重要的作用。在人類的腸上皮細(xì)胞和黏膜肌層中，Cx43表達(dá)比較豐富，研究表明結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程與縫隙連接蛋白的功能缺失和細(xì)胞質(zhì)膜上的功能再定位有關(guān)[12-13]，結(jié)腸癌樣本中，Cx43的表達(dá)較對(duì)照組顯著下調(diào)75%，且與組織型和腫瘤侵潤(rùn)型癌顯著相關(guān)，其表達(dá)具有腫瘤抑制的特性[14]。此外，已有的研究也表明Cx43的表達(dá)可能是通過(guò)干預(yù)Wnt/β-catenin通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[15]。Wnt/β-catenin通路在腸道生理學(xué)中具有形成上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用，是腸上皮干細(xì)胞識(shí)別和維持的組織者。Wnt/β-catenin通路不僅能調(diào)控胚胎發(fā)育，也對(duì)腸道自我更新具有重要的調(diào)節(jié)作用，過(guò)度活化的Wnt信號(hào)通路是UC相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵事件[16-17]。從功能上講，Wnt激活可增加體內(nèi)大鼠皮膚中傷口再上皮的速率。已有研究表明Wnt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)TNBS處理的小鼠的黏膜修復(fù)，而Wnt激動(dòng)劑處理的細(xì)胞中Cx43的核定位增加了8～10倍[13，18]。免疫熒光提示Cx32和Cx43蛋白表達(dá)量增高，并有核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，UC特征在于黏膜下水平的慢性炎癥和上皮屏障功能的破壞。本研究提示W(wǎng)nt信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)連接蛋白參與潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜的修復(fù)，縫隙連接可以介導(dǎo)腸道免疫細(xì)胞與腸上皮細(xì)胞之間的異型縫隙連接通訊，通過(guò)腸道炎癥細(xì)胞和上皮細(xì)胞建立細(xì)胞連接的復(fù)合體，從而可以易化腸黏膜屏障功能的缺陷[19]?？p隙連接蛋白在潰瘍性結(jié)腸炎中的研究較少，而縫隙連接蛋白在UC中調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，縫隙連接是細(xì)胞間重要通訊方式，且連接蛋白可能作為潰瘍性結(jié)腸炎潛在的預(yù)測(cè)標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。DNBS誘導(dǎo)的UC大鼠模型中，Cx32和Cx43參與UC的炎癥過(guò)程，尤其是Cx43在UC的疾病過(guò)程中可能具有重要的作用。