伍寶琴 黎春暉 張夢蓮 聶敏海

1.西南醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口頜面修復重建和再生實驗室，瀘州646000；2.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜病科，瀘州646000

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcino‐ma，簡稱口腔鱗癌）是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，易復發(fā)、轉移，預后差[1]，探索安全高效的口腔鱗癌治療方案具有重要的科學意義及臨床轉化價值。外泌體介導的基因及藥物運送為腫瘤治療提供了新的思路。外泌體是由細胞膜兩次內陷形成的具有雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑30～150 nm[2]。外泌體裝載了“發(fā)生細胞”的多種信號分子，如DNA、RNA、蛋白質、脂質等[3]，并通過與受體細胞的細胞膜融合，將信號分子傳遞給受體細胞，進而調控受體細胞的生理及病理過程[4]。外泌體具有較低的免疫原性，不引起炎癥反應，能夠穿過血腦屏障，并且雙層膜結構對其攜帶的內含物有很好的保護作用[5]。2015 年，Toffoli等[6]發(fā)現，用外泌體運送阿霉素可在有效抑制乳腺癌生長的同時，顯著減少藥物在心臟的聚集，降低藥物的心臟毒性。Mao 等[2]研究發(fā)現，外泌體運送人食管癌相關基因4（esophageal cancer related gene 4，ECRG4）mRNA，可有效抑制口腔鱗癌的生長。Xie 等[7]研究發(fā)現，miR-101-3p 過表達的骨髓間充質干細胞外泌體能顯著抑制口腔鱗癌的增殖、侵襲及遷移。因此，以外泌體為載體，運送腫瘤抑制基因或化學藥物對口腔鱗癌的靶向治療具有重要的意義。

微小RNA（microRNA，miR）-1 是在肺癌[8]、胃癌[9]、食管癌[10]、前列腺癌[11]等腫瘤組織中顯著低表達的非編碼RNA，增強miR-1 的表達可顯著抑制腫瘤細胞生長、增殖，促進腫瘤細胞凋亡。miR-1 對口腔鱗癌細胞的抑制作用已在SCC-4 細胞系中得以證實[12]，是極具潛力的一種腫瘤抑制因子。如何使miR-1在外泌體中大量富集以及外泌體的大規(guī)模量化生產是外泌體用于口腔鱗癌治療的技術難點。本研究用供體細胞基因過表達的方法，通過基因工程技術調控外泌體中miR-1的表達，研究外泌體介導的miR-1基因運送在口腔鱗癌治療中的作用，旨在為探索安全高效的口腔鱗癌治療方案準備條件。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

miR1 過表達質粒pri-miR1-3p-pLVX 由本實驗室前期構建，人胚胎腎細胞（human embryonic kidney cell，HEK）293 及人舌鱗癌細胞CAL-27 細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。脂質體（lipofectamine）2000、DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal calf serum，FBS）血清、抗生素、CM-DiⅠ熒光探針、逆轉錄試劑盒（Thermo fisher 公司，美國），miR-1逆轉錄、定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒及引物（Gene‐Copoeia公司，美國），Quanti Nova SYBR Green聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）Kit試劑盒（QIAGEN 公司，德國），異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin）（FITC-Phalloidin，北京索萊寶科技有限公司），anti-CD9（sc-13118）、anti-Tsg101（sc-7964）、anti-Alix（sc-53540）抗體（Santa Cruz 公司，美國），PI/RNase Staining Buffer細胞周期檢測試劑盒（BD 公司，美國）。引物由成都擎科梓熙生物科技有限公司合成。

1.2 實驗儀器

細胞培養(yǎng)箱（Thermo 3111，Thermo fisher 公司，美國）、實時熒光定量PCR儀（CFX96 Touch，Bio-rad 公司，美國）、超高速離心機（Optima L-100XP， Beckman 公司，美國）、酶標儀（Infinite M200，Tecan公司，美國）、透射電子顯微鏡（Hi‐tachi-7500，Hitachi公司，日本）、納米顆粒分析儀（NanoSight NS300，Malvern公司，美國）、倒置熒光顯微鏡（IX51，Olympus 公司，日本）、流式細胞儀（Gallios，Beckman公司，美國）。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉染

將HEK293及CAL-27細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，人口腔黏膜上皮角化細胞（normal oral keratinocyte，NOK）培養(yǎng)于Defined Keratinocyte SFM 培養(yǎng)基。采用脂質體轉染法建立過表達miR-1 的HEK293 細胞（miR1-HEK293）。轉染前1 d接種3×106個HEK293細胞于10 cm 培養(yǎng)皿中，次日取15μg pri-miR1-3ppLVX 質粒及30 μL 脂質體2000，分別經750 μL Opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋后混勻，室溫靜置10 min，均勻滴入HEK293 細胞中，細胞在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，收集細胞用于后續(xù)的qPCR檢測。

1.4 外泌體提取與鑒定

外泌體提取采用超速離心法。HEK293細胞及miR1-HEK293 細胞培養(yǎng)至密度約90%后，更換為無血清的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)基，分別經4 ℃300 g 離心15 min，取上清；4 ℃2 000 g離心15 min，取上清；4 ℃10 000 g離心30 min，取上清；4 ℃100 000 g 離心70 min，棄上清，沉淀溶于預冷的磷酸鹽緩沖液（phos‐phate buffer saline，PBS）；4 ℃100 000 g 離心70 min，沉淀為外泌體，重懸于預冷的PBS 溶液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。BCA 試劑盒檢測外泌體蛋白質濃度，透射電子顯微鏡放大150 000 倍檢測外泌體的形態(tài)，納米顆粒分析儀檢測外泌體的粒徑，West‐ern blot 檢測外泌體標志蛋白CD9、Alix、Tsg101，qPCR 檢測HEK293 細胞外泌體（CON-EXO）及miR1-HEK293 細胞外泌體（miR1-EXO）中miR-1的表達水平。

1.5 外泌體向細胞轉運

采用親脂性紅色熒光探針標記外泌體。將1 mmol·L-1的CM-DiI（C7000）加入到外泌體中，終濃度1μmol·L-1，置于37 ℃孵育30 min，4 ℃孵育15 min；4 ℃100 000 g 離心70 min，棄上清；用預冷的PBS 重懸，4 ℃100 000 g 離心70 min，棄上清，沉淀用預冷的PBS重懸。

CAL-27 細胞中加入CM-DiI 熒光標記的miR1-EXO（10 μg·mL-1），培養(yǎng)24 h 后，細胞用PBS 清洗3 次；4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS 清洗5 min，重復3 次；用0.5% Triton X-100/PBS 室溫孵育10 min，PBS 清洗5 min，重復3 次；FITCPhalloidin 室溫孵育細胞30 min，PBS 清洗5 min，重復3 次；DAPI 標記細胞核后封片，熒光顯微鏡下放大200倍進行檢測。

1.6 qPCR檢測

CAL-27細胞分別加入miR1-EXO（10μg·mL-1）、CON-EXO（10 μg·mL-1）和等體積的PBS，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，細胞用PBS 清洗3 次，用qPCR檢測細胞中miR-1及下游靶基因MET的表達水平。細胞總RNA 提取使用TRIzol 試劑進行。miR-1 表達檢測使用All-in-One?RT-PCR Detection Kit 試劑盒，以U6 為內參。mRNA 表達檢測使用逆轉錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthe‐sis Kit、實時熒光定量PCR 試劑盒SYBR Green PCR Kit。引物序列如下。MET上游引物：5’-AG‐CAATGGGGAGTGTAAAGAGG-3’，下游引物：5’-CCCAGTCTTGTACTCAGCAAC-3’。GAPDH 上游引物：5’-GAGTCCACTGGCGTCTTCA-3’，下游引物：5’-TCTTGAGGCTGTTGTCATACTTC-3’。

1.7 細胞增殖實驗

采用噻唑藍比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）檢測miR1-EXO 對CAL-27、NOK 細胞增殖的影響。

將CAL-27 細胞接種于96 孔板中（每孔5 000個）培養(yǎng)過夜后，將培養(yǎng)基分別更換為含10μg·mL-1CON-EXO、miR1-EXO、等體積PBS和0.5μmol·mL-1阿霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基，其中0.5 μmol·mL-1阿霉素作為抑制CAL27 細胞增殖的陽性對照，PBS 作為抑制CAL27 細胞增殖的陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，細胞中加入10 μL MTT（5 mg·mL-1），37 ℃培養(yǎng)箱中放置4 h，吸干培養(yǎng)基，每孔中加入150μL的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），室溫低速震蕩10 min，酶標儀檢測吸光度（OD490）。

NOK 細胞接種于96 孔板中（每孔5 000 個）培養(yǎng)過夜后，將培養(yǎng)基分別更換為含10 μg·mL-1CON-EXO、miR1-EXO、等體積PBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)了48 h 之后，再進行MTT 檢測。

1.8 細胞周期實驗

采用流式細胞術進行細胞周期檢測。CAL-27細胞接種于6 孔板中（每孔0.2×106個），培養(yǎng)過夜，細胞經無血清培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)12 h 后，分別更換為含10 μg·mL-1CON-EXO、miR1-EXO 及等體積PBS的DMEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。細胞經胰蛋白酶消化后，PBS清洗2次，用預冷的70%乙醇4 ℃下固定過夜，PBS 清洗2 次，加入500 μL PI/RNase 染液室溫避光染色15 min，流式細胞儀進行檢測。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數據結果以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 外泌體的鑒定Fig 1 Identification of exosomes

2 結果

2.1 miR1-EXO的分離純化

通過pri-miR1-3p-pLVX 質粒轉染HEK293 細胞，建立過表達miR-1 的HEK293 細胞（miR1-HEK293）。qPCR結果顯示，miR1-HEK293細胞中miR-1的相對表達量為3 053.00±85.51，HEK293細胞中miR-1 的相對表達量為0.89±0.15，二者間有統(tǒng)計學差異（P＜0.000 1），表明miR-1 在HEK293細胞中過表達成功。

超速離心法提取外泌體，透射電子顯微鏡以及納米顆粒分析儀檢測結果顯示，miR1-EXO 及CON-EXO 均呈典型的球形或者杯狀結構，直徑主要集中在110 nm，Western blot 結果顯示，miR1-EXO 以及CON-EXO 均高表達外泌體標志性蛋白CD9、Alix及Tsg101，且二者的形態(tài)結構及粒徑無明顯差異，均符合外泌體的經典特征（圖1）。

qPCR 結 果 顯 示，miR1-EXO 中miR-1 的表達量為285.80±14.33，CON-EXO 的表達量為1.00±0.06，二者間有統(tǒng)計學差異（P＜0.000 1）。這表明，供體細胞基因過表達的方法可使外泌體成功裝載大量miR-1，并且大量裝載miR-1 并未改變外泌體的形態(tài)結構。

2.2 外泌體介導miR-1轉運

免疫熒光檢測結果顯示，與CAL-27 共培養(yǎng)后，miR1-EXO 被CAL-27 細胞攝取，主要分布在細胞質中，圍繞在細胞核周圍（圖2）。qPCR 結果顯示，miR1-EXO 組CAL-27 細胞的miR-1 表達水平高于CON-EXO組及PBS組（P＜0.000 1），CONEXO 組與PBS 組間無統(tǒng)計學差異（miR1-EXO，5.75±0.23；CON-EXO，1.23±0.23；PBS，1.03±0.13。圖3A），表明miR1-EXO 將攜帶的miR-1 運送到了CAL-27細胞。

圖2 CAL-27細胞攝取外泌體Fig 2 Uptake of exosomes by CAL-27 cells

qPCR 檢測CAL-27 細胞中miR-1 下游靶基因MET mRNA 的表達變化，結果顯示，miR1-EXO組MET mRNA 的表達水平下調，與CON-EXO 組、PBS 組間有統(tǒng)計學差異（miR1-EXO，0.27±0.04；CON-EXO，0.92±0.03；PBS，1.00±0.04）（圖3B），表明miR1-EXO 具有生物學活性，與CAL-27 細胞融合后，顯著抑制了miR-1下游靶基因MET mRNA的表達。

2.3 miR1-EXO抑制CAL-27細胞增殖

MTT 及細胞周期檢測結果顯示，miR1-EXO組CAL-27 細胞活力低于CON-EXO 組和PBS 組，CON-EXO 組和PBS 組間無統(tǒng)計學差異（miR1-EXO，0.79±0.03；CON-EXO，0.93±0.02；PBS，1.00±0.07；阿霉素，0.59±0.03）（圖3C）；miR1-EXO組G0/G1期細胞比例高于CON-EXO組和PBS組，S 期及G2/M 期細胞比例呈現略低于CONEXO組和PBS組的趨勢，但無統(tǒng)計學差異（圖4）。這表明，CON-EXO 不影響CAL-27細胞增殖過程，而miR1-EXO 使CAL-27 細胞大量停滯在G0/G1期，阻滯細胞由G0/G1 期進入S 期，最終抑制CAL-27細胞增殖。

NOK細胞MTT檢測結果顯示，miR1-EXO組、CON-EXO 組的NOK 細胞活力略低于PBS 組（mi-R1-EXO，0.93±0.03；CON-EXO，0.95±0.03；PBS，1.00±0.04）（圖3D）。雖然miR1-EXO、CON-EXO與PBS 之間的差異具有統(tǒng)計學意義，但差值很小，miR1-EXO 和CON-EXO 對NOK 細胞活力的影響微乎其微，可以排除2種外泌體對正常口腔上皮細胞具有細胞毒性的風險。

圖3 外泌體運送miR-1抑制CAL-27細胞增殖Fig 3 miR-1 was delivered into CAL-27 cells by exosomes and inhibited cell proliferation

圖4 外泌體運送miR-1阻滯CAL-27細胞分裂Fig 4 miR-1 was delivered into CAL-27 cells by exosomes and inhibited cell division

3 討論

外泌體是細胞內源分泌的納米尺寸囊泡，無免疫原性，不引起炎癥反應，可作為一種潛在的藥物運送載體。因此，如何使具有治療作用的外源基因和藥物在外泌體中富集是外泌體治療的技術難點。研究顯示，反復凍融[13]、電穿孔[14]、超聲波處理[15]及基因工程[2]等方式都可以用于外源基因、化合物在外泌體中的富集。反復凍融、電穿孔及超聲波處理是將外泌體提純后，通過物理手段改變外泌體的膜結構，使外源基因或藥物進入到外泌體中，可以理解為外泌體被動裝載的過程。

本研究根據外泌體形成的生物學過程，用基因工程的方式將miR-1在供體細胞過表達，進而供體細胞的細胞膜內陷形成外泌體時，就會主動包裹胞漿中大量存在的miR-1，可以理解為外泌體主動裝載的過程。本研究中miR1-HEK293 細胞外泌體的miR-1 含量大量增加，并且miR-1 的大量富集并沒有改變外泌體的形態(tài)結構。用抗生素篩選、流式分選等方法建立miR1-HEK293 穩(wěn)定表達的細胞株，就可以用于源源不斷的產生大量富集miR-1的外泌體。因此，供體細胞基因工程修飾的方式不僅可以作為外泌體裝載外源基因的有效手段，而且為大量富集外源基因的外泌體的大規(guī)模量化生產奠定了重要的基礎。

外泌體介導的基因及藥物運送為腫瘤靶向治療提供了新的思路。Hadla 等[16]證實，外泌體可提高阿霉素對小鼠乳腺癌和卵巢癌的治療效果，并降低藥物的心臟毒性。Mao 等[2]證實，用外泌體運送人食道癌相關基因4，可有效抑制口腔鱗癌的生長。Naseri 等[17]用骨髓間充質干細胞外泌體運送miRNA-142-3p拮抗劑，可抑制乳腺癌的發(fā)生。

miR-1是骨骼肌細胞發(fā)育的重要調控因子，在骨骼肌中廣泛存在，在腫瘤組織中其表達量顯著降低。研究顯示，在前列腺癌[9,18]、肺癌[19]和結腸癌[20]模型中，miR-1 通過抑制原癌基因MET 的表達，抑制腫瘤細胞生長。miR-1可通過與原癌基因MET mRNA 的3’UTR 結合，抑制基因表達，通過負調控Met/Akt/mTOR 信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[18]。本研究發(fā)現，大量裝載miR-1的外泌體可以將miR-1運送到CAL-27細胞，使MET表達下調，延緩細胞由G0/G1期進入S期，抑制細胞生長。由此推測，外泌體介導的miR-1運送可能通過負調控MET 及其下游信號通路，抑制CAL-27細胞增殖。

外泌體是否具有潛在的細胞毒性是決定其能否用于腫瘤臨床治療的重要問題。本研究結果表明，miR1-EXO 顯著抑制了口腔鱗癌CAL-27 細胞增殖，而對NOK 細胞不具有細胞毒性，證明了外泌體運送miR-1用于口腔鱗癌治療的有效性和安全性。本研究用供體細胞過表達的方法實現了外泌體裝載并運送腫瘤抑制基因，抑制腫瘤細胞生長，為外泌體介導的口腔鱗癌的靶向治療準備了必要的條件。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。