陳 潔，廖國(guó)禮，吳玉嬌，張 慶，楊小娟，范曉東，，龍夢(mèng)嫻，潘國(guó)慶，周澤揚(yáng)，

1.西南大學(xué) 家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/微孢子蟲感染與防控重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院 珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；3.重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶 401331

微孢子蟲作為一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生、密度依賴性的單細(xì)胞真核寄生蟲，可寄生幾乎所有的動(dòng)物(包括人類)和部分原蟲[1-2]．2009年，Tourtip等[3]從生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦中分離、鑒定了一種新的微孢子蟲并命名為蝦肝腸胞蟲Enterocytozoonhepatopenaei．該微孢子蟲隨后在各對(duì)蝦養(yǎng)殖國(guó)家，特別是亞洲地區(qū)進(jìn)行快速傳播，已成為影響凡納濱對(duì)蝦和斑節(jié)對(duì)蝦育種、育苗及養(yǎng)殖的重要病原．

微孢子蟲的孢外感染期為休眠孢子，具有由幾丁質(zhì)和蛋白等組成的厚厚的孢壁，一般的藥物難以透過造成殺傷．微孢子蟲侵染時(shí)通過發(fā)芽的方式彈出侵染裝置——極管，將具有侵染性的孢原質(zhì)輸入到宿主細(xì)胞內(nèi)，或孢子利用內(nèi)吞途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖[1]．微孢子蟲的胞內(nèi)增殖期分為裂殖增殖期和孢子形成期，具包膜或直接與宿主細(xì)胞質(zhì)接觸，是微孢子蟲快速增殖的時(shí)期．鑒于微孢子蟲獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生活史，至今尚未開發(fā)出特異有效的治療藥物．應(yīng)對(duì)微孢子蟲病最有效的措施在于防控，而檢測(cè)是診斷和控制疾病流行的重要手段．

各國(guó)學(xué)者針對(duì)蝦肝腸胞蟲的檢測(cè)開展了諸多組織病理學(xué)和分子生物學(xué)的研究，尤以基于核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)法研究較多．2009年，Tourtip等[3]采用SSU-PCR法鑒定了蝦肝腸胞蟲．隨后10年間，研究者們報(bào)道了蝦肝腸胞蟲的原位雜交法、基于核糖體小亞基SSU rDNA，孢壁蛋白SWP，微管蛋白β-tubulin基因序列的巢式PCR法[4-7]、SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[8]、TaqMan實(shí)時(shí)熒光探針定量檢測(cè)法[9-11]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)及其衍生的多種實(shí)時(shí)或可視化產(chǎn)品[12-16]、重組酶介導(dǎo)的核酸快速擴(kuò)增法(Recombinase-aid amplification，RAA)[17]等．在組織病理學(xué)檢測(cè)方面，常曉晴等[18]通過比較8種不同染色方法提出Masson(馬松)染色法最適于檢測(cè)病理組織切片中的EHP．

在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，除了考慮檢測(cè)方法的特異性、靈敏性和簡(jiǎn)便性，檢測(cè)成本和效率因素也常被納入評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)．宋增磊等[19]推薦在定性上采用50∶1 的并樣進(jìn)行qPCR檢測(cè)以縮短檢測(cè)時(shí)間和降低成本．Cruz-Flores等[20]采用1 mL注射器在對(duì)蝦肝胰腺的特定位置針刺取樣，實(shí)現(xiàn)對(duì)蝦的非致命抽樣，可用于親蝦的檢測(cè)，評(píng)估其無(wú)特定病原體(Specific pathogen Free，SPF)狀態(tài)．Thamizhvanan等[21]采用多重PCR技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)樣品中的EHP和對(duì)蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)，提高了多病原檢測(cè)的效率，降低了檢測(cè)成本．Karthikeyan等[22]報(bào)道了采用FTA卡(WhatmanTMFTA cards)在常溫下進(jìn)行樣品核酸收集、運(yùn)輸和純化以替代送檢過程的低溫活體運(yùn)輸，降低了送檢成本．

以上方法的建立，無(wú)疑對(duì)于蝦肝腸胞蟲的檢測(cè)及防控具有重要意義，并且已應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖各個(gè)環(huán)節(jié)的跟蹤檢測(cè)．特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是目前病原分子檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)．2020年，Zhao等[23]報(bào)道了利用Calcofluor white檢測(cè)對(duì)蝦糞便和組織樣品中的EHP孢子，此方法將推動(dòng)EHP的快速鏡檢．本研究主要基于微孢子蟲孢子在光鏡下具有高度折光性、孢壁結(jié)構(gòu)的特殊性以及孢原質(zhì)膜的特殊透過性，通過比較普通光鏡成像、微分干涉差成像以及單、雙色熒光顯微成像的光鏡檢測(cè)方法，為蝦肝腸胞蟲的早期篩查及養(yǎng)殖塘樣品的快速診斷提供價(jià)廉、省時(shí)且易操作的檢測(cè)手段．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

生長(zhǎng)滯后的凡納濱對(duì)蝦取自廣東省沙堆鎮(zhèn)及大鰲鎮(zhèn)養(yǎng)殖塘．采集時(shí)取樣品肝胰腺均分后液氮速凍，干冰運(yùn)輸至微孢子蟲感染與防控重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 樣品處理

取檢測(cè)EHP陽(yáng)性的肝胰腺組織備樣置于干凈的1.5 mL離心管中，采用手持式微量勻漿器(LABGIC，TH-Mini)處理30 s，獲得樣品懸液待用．

1.3 普通光鏡樣品制片及觀察

勻漿處理后的待檢樣品懸液制備為臨時(shí)裝片，采用微分干涉差顯微鏡檢查法進(jìn)行檢測(cè)．取移液器吸取10 μL或蘸取少量樣品懸液，用水或PBS溶液稀釋10倍后滴加于干凈載玻片，蓋上蓋玻片制成臨時(shí)裝片，采用帶有100倍微分干涉差(Differential interference contrast，DIC)鏡頭的光學(xué)顯微鏡(OLYPUS，BX53F)進(jìn)行普通光學(xué)觀察和微分干涉差觀察．

1.4 熒光光鏡樣品處理及觀察

勻漿處理后的待檢樣品懸液，采用熒光增白劑染色法或雙色熒光法進(jìn)行檢測(cè)．熒光增白劑Fluorescent Brightener 28(sigma)母液(1 mg/mL)用水稀釋1 000倍為幾丁質(zhì)染色液備用．取儲(chǔ)存質(zhì)量濃度為1 mg/mL的碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)用幾丁質(zhì)染色液稀釋1 000倍為雙染工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)．取樣品與50 μL染色液混勻，室溫靜置孵育5 min，吸取適量滴加于多聚賴氨酸包被的載玻片制成臨時(shí)裝片，置熒光顯微鏡下(OLYPUS，BX53F)，分別選取紫外光和綠色光激發(fā)濾板進(jìn)行觀察．

2 結(jié) 果

2.1 微分干涉差顯微成像

在光學(xué)顯微鏡下，蝦肝腸胞蟲感染的肝胰腺組織中可看到孢子存在，呈淺綠色折光性(圖1)．相較于普通的光學(xué)顯微觀察而言，微分干涉差(DIC)顯微觀察下孢子的形態(tài)更清晰和立體，與組織間的界限更明顯，且可分辨出發(fā)芽后的孢子空殼，如圖1中黑色箭頭所示．發(fā)芽后的孢子因孢原質(zhì)彈出而不再飽滿，折光性喪失，中心區(qū)域與邊緣呈現(xiàn)出明顯的界限．發(fā)芽是微孢子蟲特有的侵染方式，所以可以通過發(fā)芽與否將微孢子蟲孢子與其他真菌孢子區(qū)別開來(lái)．DIC下觀察到的孢子空殼可作為蝦肝腸胞蟲的佐證．

黑色箭頭標(biāo)示空孢殼．圖1 微分干涉差顯微鏡檢查法觀察凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織勻漿中的EHP

2.2 EHP的單色熒光顯微成像

微孢子蟲孢內(nèi)壁為增厚的幾丁質(zhì)層，可與熒光增白劑(Fluorescent Brightener 28，F(xiàn)B 28)結(jié)合，在紫外激發(fā)光下呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色熒光，這也是其區(qū)別于真菌孢子的重要特征之一．如圖2所示，經(jīng)FB 28染色后的肝胰腺組織勻漿，在紫外激發(fā)光下可見清晰的卵圓形孢子，孢壁均勻著色與背景形成強(qiáng)烈對(duì)比．

圖2 熒光增白劑染色法檢測(cè)EHP孢子

2.3 EHP的雙色熒光顯微成像

采用FB 28和PI對(duì)蝦肝腸胞蟲樣品進(jìn)行染色后，可見同一孢子內(nèi)幾丁質(zhì)層標(biāo)記為藍(lán)色熒光，細(xì)胞核標(biāo)記為紅色熒光(圖3)．發(fā)芽后的孢子由于孢原質(zhì)已輸出，僅留下孢壁結(jié)構(gòu)，因此可見僅染上藍(lán)色熒光的孢殼(圖3)．由于FB 28和PI處于游離狀態(tài)時(shí)熒光較弱，分別與幾丁質(zhì)和DNA結(jié)合后才可見強(qiáng)烈的聚集性熒光，且微孢子蟲孢子細(xì)胞膜的特殊透過性使PI能夠進(jìn)入活孢子內(nèi)部進(jìn)行染色，因此實(shí)驗(yàn)過程不需要進(jìn)行樣品的固定和洗滌．

以真菌釀酒酵母Saccharomycescerevisiae和分離自對(duì)蝦腸道的細(xì)菌乙酰微小桿菌Exiguobacteriumacetylicum進(jìn)行活細(xì)胞染色開展對(duì)比實(shí)驗(yàn)．如圖3可見，釀酒酵母因其細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)成分，能夠被FB 28染上藍(lán)色熒光，但是PI不能透過酵母細(xì)胞壁，且酵母細(xì)胞與蝦肝腸胞蟲孢子細(xì)胞大小、形態(tài)具有明顯的區(qū)別，顯微鏡下熒光強(qiáng)度亦弱于蝦肝腸胞蟲孢子．乙酰微小桿菌因不含有幾丁質(zhì)成分則不能被FB 28染色，PI亦不能透過細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色．

a-d.蝦肝腸胞蟲；e-h.釀酒酵母；i-l.乙酰微小桿菌．A.微分干涉差；B.C和D的疊加圖；C.熒光增白劑(Fluorescent Brightener 28)使幾丁質(zhì)層染上藍(lán)色熒光；D.碘化丙啶(Propidium Iodide)能透過EHP孢子細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染上紅色熒光，不能透過酵母和細(xì)菌的細(xì)胞膜．以真菌釀酒酵母(e-h)，細(xì)菌乙酰微小桿菌(i-l)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，本文方法可有效區(qū)分蝦肝腸胞蟲與其他真菌和細(xì)菌．圖3 雙色熒光法檢測(cè)蝦肝腸胞蟲孢子

3 結(jié) 語(yǔ)

蝦肝腸胞蟲Enterocytozoonhepatopenaei，EHP感染不會(huì)引起對(duì)蝦如凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦等快速死亡．對(duì)蝦感染EHP后主要表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢或停滯的癥狀，故而延長(zhǎng)養(yǎng)殖周期，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)投入，同時(shí)對(duì)蝦發(fā)育不齊導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益大打折扣，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失．對(duì)蝦育種、育苗過程中，EHP可從親蝦傳染到子代且很難從培育體系中去除[24]．蝦苗攜帶EHP，特別是在高密度養(yǎng)殖情況下影響對(duì)蝦發(fā)育，且EHP感染易伴隨其他病原體如傳染性皮下及造血組織壞死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)[25]、白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)[21]和弧菌[26]等的合并感染，從而進(jìn)一步擴(kuò)大危害．

目前沒有可殺滅微孢子蟲又不影響宿主生長(zhǎng)的特效藥物，僅有煙曲霉素及其類似物、苯并咪唑(如阿苯達(dá)唑)、托曲珠利、硝唑尼特、莫能菌素等對(duì)部分物種有一定的抑制效果[1]．因此，養(yǎng)殖前的消毒防控，養(yǎng)殖中的環(huán)境及飼料保障、跟蹤檢測(cè)并及時(shí)廢棄仍然是目前防控微孢子蟲病最有效的方法．以往的研究者采用特異性抗體通過免疫熒光或免疫印跡等方法實(shí)現(xiàn)了微孢子蟲的特異檢測(cè)[27-28]．隨后針對(duì)孢子表面特異蛋白和核酸等開發(fā)出了一系列特異靈敏的分子檢測(cè)方法，這些方法也在對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用到了EHP檢測(cè)，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)成為EHP分子檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)．這些檢測(cè)技術(shù)主要應(yīng)用在執(zhí)行檢測(cè)職能的事業(yè)單位、大型育苗和養(yǎng)殖企業(yè)、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)，因設(shè)備成本和檢測(cè)人員的專業(yè)限制，尚不能應(yīng)用于養(yǎng)殖一線．

利用光學(xué)顯微鏡對(duì)病原進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定是應(yīng)用最廣泛且簡(jiǎn)便實(shí)用的方法．不同種類的微孢子蟲具有大小不一、形狀多樣的孢子，在光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)出高度折光性，其形態(tài)特征可應(yīng)用于快速檢測(cè)．如應(yīng)用于蠶業(yè)檢疫的母蛾鏡檢法就是利用了家蠶微粒子蟲孢子的折光性和已知的大小、形態(tài)特點(diǎn)來(lái)檢測(cè)[29]．微分干涉差或相差顯微成像的應(yīng)用使孢子更易于觀察，有助于經(jīng)過培訓(xùn)的人員進(jìn)行快速鏡檢．但是大多數(shù)微孢子蟲的孢子很小，且許多寄生蟲學(xué)中常用的染色方法對(duì)微孢子蟲孢子著色效果并不理想．蝦肝腸胞蟲的孢子為卵圓形，大小為0.7×1.1 μm[3]，為鏡檢增加了難度．熒光增白劑(Calcofluor white M2R或Fluorescent Brightener 28)可與幾丁質(zhì)的β-1，4糖苷鍵特異結(jié)合，是普遍用于微孢子蟲孢子染色的方法[30-31]．熒光增白劑能使微孢子蟲孢子染上強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，細(xì)菌和病毒因不具有幾丁質(zhì)而不能著色．雖然真菌孢子和宿主的幾丁質(zhì)成分也能被其染色，但是熒光較弱或可通過形態(tài)進(jìn)行區(qū)分．采用Fluorescent Brightener 28和Propidium Iodide(PI)雙色熒光法對(duì)固定后的樣品進(jìn)行染色，可分別對(duì)微孢子蟲的幾丁質(zhì)層和細(xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記，能進(jìn)一步排除組織細(xì)胞和幾丁質(zhì)碎片的干擾[32-33]．PI一般情況下不能透過細(xì)胞膜，主要應(yīng)用于死細(xì)胞的核染色．本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，微孢子蟲膜結(jié)構(gòu)的特殊透過性使得PI能夠進(jìn)入活的微孢子蟲對(duì)其細(xì)胞核進(jìn)行染色[34]．因此，本研究所描述的雙色熒光標(biāo)記法摒棄了細(xì)胞固定及洗滌的步驟，僅需對(duì)組織樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的勻漿處理和染色孵育，并進(jìn)一步排除其他具有幾丁質(zhì)層單細(xì)胞真核生物的影響．整個(gè)過程簡(jiǎn)單、快速，總耗時(shí)不超過10 min，且操作和結(jié)果判讀不具有專業(yè)性要求，單次檢測(cè)成本極低，可視化的熒光顯微鏡亦在國(guó)內(nèi)有量產(chǎn)，非常適合在苗場(chǎng)及養(yǎng)殖一線的服務(wù)站中推廣．通過熒光篩查，可初步判斷養(yǎng)殖塘出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢綜合征的對(duì)蝦樣品是否可能由蝦肝腸胞蟲感染所致，可對(duì)病情做出及時(shí)判斷，降低養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)．陽(yáng)性結(jié)果再輔以核酸定性、定量檢測(cè)．采用該方法，即使只有1個(gè)孢子也能通過染色觀察進(jìn)行快速鏡檢，且可對(duì)分子檢測(cè)靈敏度下限的樣品進(jìn)行快速的補(bǔ)正檢查．通過本研究，可為蝦肝腸胞蟲病的檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用的方法．