李楊，張曉杰，尹敏，王立增，曹大偉，鄭霞

1.山東泰邦生物制品有限公司，山東 泰安 271000；2.泰安市婦幼保健院，山東 泰安 271000

熱原是能引起恒溫動(dòng)物產(chǎn)生異常升溫情況的致熱物質(zhì)的總稱。熱原在注射入人體后可能會(huì)引起寒戰(zhàn)、發(fā)燒、嘔吐等情況，甚至?xí){生命，熱原檢查對(duì)于靜脈注射類藥品質(zhì)量的控制尤為關(guān)鍵。藥典規(guī)定的熱原檢查法是家兔法熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法熱原檢查。家兔法熱原檢查是將一定劑量的待檢藥品通過家兔靜脈注射入家兔體內(nèi)，通過家兔體溫變化情況判定檢測(cè)藥品中是否含有熱原，家兔具有與人類相似的發(fā)熱機(jī)理［1］，并且與能引起人類發(fā)熱的最小細(xì)菌內(nèi)毒素的劑量基本一致。家兔法熱原檢查反映出的各種熱原在機(jī)體中的表現(xiàn)與臨床反應(yīng)相近，適用于檢查較多種類的熱原物質(zhì)，是我國藥品和生物制品質(zhì)量評(píng)價(jià)中常用的熱原檢查方法［2］。細(xì)菌內(nèi)毒素是藥品生產(chǎn)中最常見、危害最大的一類熱原物質(zhì)，也是熱原檢查的主要目標(biāo)。鱟試劑法僅能檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素，不能檢測(cè)其他種類的熱原［3］。本研究將不同劑量的細(xì)菌內(nèi)毒素注射入家兔靜脈，統(tǒng)計(jì)家兔的升溫情況，考察內(nèi)毒素劑量與家兔升溫之間的關(guān)系，提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性與可靠性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：立鶴牌 502 型），低壓漩渦攪拌機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司，型號(hào)：G8KT18057），微機(jī)熱原測(cè)定儀（上海遼卓科貿(mào)有限公司，型號(hào)：WRY-2015 型），熱原測(cè)定程序（上海遼卓科貿(mào)有限公司，型號(hào)：Pyrogen Test Expert 2015），10 mL 注射器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司，批號(hào)：190615）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：10 EU/支，批號(hào)：1905311），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：5 mL/支，批號(hào)：1904250），氯化鈉注射液（0.9%生理鹽水，重慶三大偉業(yè)制藥有限公司，批號(hào)：20190831）。

1.3 實(shí)驗(yàn)用家兔

普通級(jí)家兔24 只，品種為新西蘭大白兔，體質(zhì)量1.7～3.0 kg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（魯）2018-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可：SYXK（魯）2018-0001，飼養(yǎng)條件：溫度17～25 ℃，濕度40～70%。家兔按照《中國藥典》2015 版通則中熱原檢查法進(jìn)行預(yù)選。

1.4 器材準(zhǔn)備

基于本公司驗(yàn)證的除熱原程序，將安瓿瓶用錫箔紙包住，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，240 ℃，干烤2 h，除去熱原。

1.5 細(xì)菌內(nèi)毒素供試液制備

取10 EU/支的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品15 支，分別用1 mL 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶，封口膜包好，置于旋渦震蕩儀上震蕩15 min，用0.9%氯化鈉注射液將內(nèi)毒素配成0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 EU/mL 的溶液，按家兔體質(zhì)量每1 kg 注射1 mL，即家兔內(nèi)毒素注射劑量分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、10.0 EU/mL 的內(nèi)毒素供試液。

1.6 熱原檢查家兔法

1.6.1 家兔預(yù)選 選擇1.7～3.0 kg 的新西蘭大白兔，健康無異常。預(yù)測(cè)體溫前7 d 用同一批飼料喂養(yǎng)，在此期間，體質(zhì)量無減輕，精神、食欲、排泄等無異常情況。本次試驗(yàn)是采用未經(jīng)任何試驗(yàn)的家兔，按照《中華人民共和國藥典》通則1142［4］，每隔30 min 測(cè)溫1 次，共測(cè)溫8 次。選用家兔體溫均在38.0～39.6 ℃之間，且溫差不超過0.4 ℃的家兔。

1.6.2 試驗(yàn)步驟 24 只家兔分為8 組，每組3 只，分別將0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 EU/mL的溶液，按家兔體質(zhì)量每1 kg 注射1 mL，每個(gè)劑量注射3 只家兔，生理鹽水作為空白對(duì)照組，同樣每1 kg 家兔注射1 mL，注射3 只家兔，注射后每30 min 測(cè)溫一次，共測(cè)溫6 次，觀察注射后3 h 家兔的升溫情況。按照《中華人民共和國藥典》通則1142［4］進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

空白對(duì)照（CK）組，0.25 EU/kg 組和0.5 EU/kg組溫度比較平穩(wěn)，基本無升溫現(xiàn)象。1 EU/kg 組的家兔，三只家兔溫度稍有波動(dòng)，但個(gè)體升溫和升溫總和均符合藥典規(guī)定。2 EU/kg 組的家兔，有一只家兔升溫超過0.6 ℃。2.5 EU/kg 組的家兔，有一只家兔升溫超過0.6 ℃，升溫總和超過1.3 ℃。5 EU/kg 組的家兔，2 只家兔升溫超過0.6 ℃，且升溫總和超過1.3 ℃。0.5 EU/kg 至10 EU/kg 的注射劑量存在明顯的劑量關(guān)系，見表1、圖1。

圖1 細(xì)菌內(nèi)毒素注射劑量與家兔體溫升溫總和的關(guān)系

3 討論

從本次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，家兔在0.5 EU/kg 的內(nèi)毒素注射劑量以下，家兔均沒有明顯的升溫現(xiàn)象；內(nèi)毒素注射劑量在1 EU/kg 及以上時(shí)，家兔的體溫有明顯的升高，升溫存在個(gè)體差異，在同一注射量下，家兔的升溫差異很大，可達(dá)到0.58 ℃。

本次試驗(yàn)熱原檢查家兔法內(nèi)毒素靈敏度為大于5 EU/kg，家兔總體均有明顯升溫，內(nèi)毒素注射劑量與家兔升溫度數(shù)存在劑量關(guān)系。內(nèi)毒素注射劑量在家兔升溫閾值之上時(shí)，組內(nèi)家兔至少有2 只升溫超過0.6 ℃。

從本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，家兔的個(gè)體因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響較大，家兔并不是穩(wěn)定的化學(xué)試劑，不同家兔對(duì)內(nèi)毒素的靈敏度均有差異，實(shí)驗(yàn)室潔凈度，實(shí)驗(yàn)人員的注射手法，家兔的基礎(chǔ)體溫等都對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響［5-6］。因此家兔法檢測(cè)熱原的方法，僅能檢測(cè)供試品所含熱原是否超過質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的限度，不能從家兔的升溫度數(shù)確定內(nèi)毒素的含量。如家兔法熱原檢查初試結(jié)果偏高，進(jìn)行復(fù)試后結(jié)果仍舊偏高，基本可以排除家兔個(gè)體差異的因素，可以從其他方面探究原因。

探究?jī)?nèi)毒素注射劑量與家兔升溫值之間關(guān)系，雖然不能確定內(nèi)毒素的具體含量，但是能大致推測(cè)內(nèi)毒素含量的區(qū)間范圍，對(duì)企業(yè)藥品質(zhì)量控制提供了一定的參考依據(jù)。實(shí)際生產(chǎn)中，若產(chǎn)品熱原檢查結(jié)果數(shù)值雖符合藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，卻呈現(xiàn)較高的趨勢(shì)時(shí)，應(yīng)考慮其熱原水平是否較高的可能，并需要引起足夠的重視。

表1 注射不同劑量細(xì)菌內(nèi)毒素后家兔體溫變化

家兔法熱原檢查和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法熱原檢查是目前應(yīng)用最廣泛的兩種熱原檢查方法，但是有其固有的缺點(diǎn)，相關(guān)藥品企業(yè)可以采用兩種方法結(jié)合檢測(cè)藥品中熱原含量是否超過限度，提高藥品質(zhì)量，維護(hù)病人用藥安全。目前，包括全血法、單核細(xì)胞系法與人外周血單個(gè)核細(xì)胞在內(nèi)的體外熱原檢查法得到了廣泛研究，研究建立單核細(xì)胞法代替上述兩種傳統(tǒng)熱原檢測(cè)方法是熱原檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)展的整體趨勢(shì)［7-8］。

由于現(xiàn)有方法的局限性，我們并不能直接根據(jù)家兔的升溫情況判定熱原的含量，隨著人們對(duì)熱原物質(zhì)的不斷認(rèn)知，發(fā)熱機(jī)理的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，以及檢測(cè)方法的不斷提高，可能會(huì)有靈敏度、準(zhǔn)確度更高的方法準(zhǔn)確檢測(cè)出供試品中熱原的種類與含量，大大提高檢測(cè)人員的檢測(cè)效率，增加用藥安全。