張 輝，黃有興，王美娜

（1.海南省藥品和醫(yī)療器械審評服務(wù)中心，海南 ?？?570216； 2.海南海靈化學(xué)制藥有限公司，海南 ?？?570311）

泊沙康唑是伊曲康唑的衍生物，為第2代三唑類抗真菌藥物［1］，抗菌譜更廣，抗菌作用更強，對念珠菌、各種曲霉菌及其他致病真菌均有較強活性［2-3］，適用于因免疫功能嚴(yán)重低下而具有高風(fēng)險感染侵襲性曲霉菌和念珠菌的患者。建立相應(yīng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法，從源頭上減少內(nèi)毒素污染風(fēng)險，對于泊沙康唑注射劑成品的質(zhì)量控制及臨床用藥安全具有重要意義。目前尚未見泊沙康唑原料細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法學(xué)研究的相關(guān)報道。為此，本研究中參考國內(nèi)其他藥物相應(yīng)研究［4-9］，并依據(jù)2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法相應(yīng)規(guī)定［10］和其他國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)［11-12］，并參考2021年版《英國藥典》（BP2021）和2020年版《美國藥典-國家處方集》（USP-NF2020），建立了泊沙康唑細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查方法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；漩渦混勻器（德國IKA公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥

泊沙康唑原料藥（博瑞制藥<蘇州>有限公司，批號分別為SPO-I-210401、SPO-I-200305、SPO-I-200306）；鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號為2007203；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號為21030112；規(guī)格均為每支0.1 mL，靈敏度均為0.125 EU/mL）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-202089，規(guī)格為每支90 EU）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET 用水，湛江安度斯生物有限公司，批號為2010210，規(guī)格為每瓶100 mL）；N，N- 二甲基甲酰胺（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為20200422，規(guī)格為每瓶500 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 限值確定

泊沙康唑臨床1次最大劑量為800 mg/kg，則成人每千克體質(zhì)量每小時的最大劑量（M）為13.33 mg/（kg·h），注射劑成人每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量（K）= 5 EU/（kg·h），根據(jù)公式內(nèi)毒素限值（L）=K/M，計算，則L= 0.37 EU/ mg，從嚴(yán)控制，限值定為0.3 EU/mg。根據(jù)公式MVC=λ/L［7，9-10］計算供試品最小有效稀釋質(zhì)量濃度（λ 為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），得C0.50= 1.666 mg/ mL、C0.25= 0.833 mg/ mL、C0.125=0.416mg/mL、C0.06=0.2mg/mL、C0.03=0.1mg/mL；在不低于對應(yīng)最小有效稀釋質(zhì)量濃度條件下進行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品適量，加BET用水分別制備成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的溶液，以BET用水為陰性對照（NC），依照2020年版《中國藥典（四部）》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定［10］，對使用的2批鱟試劑進行復(fù)核試驗，結(jié)果實測靈敏度（λc）與標(biāo)示靈敏度一致，詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果Tab.1 The verification results of tachypleus amebocyte lysate（TAL）sensitivity test

2.3 預(yù)干擾試驗Ⅰ

泊沙康唑不溶于水，需用N，N- 二甲基甲酰胺溶解制成供試品溶液，用0.125 EU/mL 鱟試劑進行預(yù)干擾試驗。泊沙康唑溶解后制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的供試品溶液，加BET 用水分別稀釋，制得質(zhì)量濃度為3.332，1.666，0.833，0.417，0.2，0.1 mg/mL 的系列陰性對照（NPC）溶液；取除0.1 mg/mL質(zhì)量濃度外的上述溶液，對半稀釋加入4λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制得質(zhì)量濃度分別為1.666，0.833，0.417，0.2，0.1 mg/mL 的系列陽性對照（PPC）溶液。取上述兩組溶液進行干擾預(yù)試驗，并設(shè)陽性對照（PC）和陰性對照（NC）各2管。結(jié)果見表2。

表2 供試品干擾預(yù)試驗Ⅰ結(jié)果Tab.2 Results of the pre-interference test Ⅰ

可見，泊沙康唑溶液僅在質(zhì)量濃度為0.1 mg/ mL時，對內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)無干擾?？紤]N，N-二甲基甲酰胺本身濃度過高，對內(nèi)毒素檢查有一定的干擾作用。故需考察該溶劑不對內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)產(chǎn)生干擾的濃度，再重新進行預(yù)干擾試驗。

2.4 溶劑對細(xì)菌內(nèi)毒素的干擾試驗

溶劑預(yù)干擾試驗：取N，N-二甲基甲酰胺適量，加BET 用水分別稀釋至4%，2%，1%，0.5%，0.25%體積分?jǐn)?shù)，作為NPC。同時制備含有2λ 內(nèi)毒素的相同濃度N，N-二甲基甲酰胺溶液，作為PPC，均采用0.125 EU/mL鱟試劑，依照藥典方法進行干擾試驗，并設(shè)PC 和NC管。結(jié)果見表3?？芍?，N，N-二甲基甲酰胺體積分?jǐn)?shù)在0.25%～2%時，對內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)無干擾作用，故正式干擾試驗中選擇其體積分?jǐn)?shù)為0.25%～2%。

表3 溶劑對細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)的影響Tab.3 Effect of solvent on the reaction of bacterial endotoxin with TAL

正式干擾試驗：取內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品適量，加BET 用水稀釋分別配成2λ、λ、0.5λ、0.25λ 的溶液，同時制備含相同內(nèi)毒素的2%N，N-二甲基甲酰胺溶液，進行干擾試驗。結(jié)果顯示，在N，N-二甲基甲酰胺體積分?jǐn)?shù)≤2%時對內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)均無明顯干擾。詳見表4。

表4 溶劑干擾試驗結(jié)果Tab.4 Results of the interference test

2.5 干擾預(yù)試驗Ⅱ

取泊沙康唑0.5 g，精密稱定，加5 mLN，N- 二甲基甲酰胺溶解，配成100 mg/mL 的溶液，用BET 用水分別稀釋，即得泊沙康唑質(zhì)量濃度分別為1.666，0.833，0.417，0.2，0.1 mg/ mL 的系列NPC 溶液，另外制備上述質(zhì)量濃度溶液中含有2λ 細(xì)菌內(nèi)毒素的PPC 溶液，進行預(yù)干擾試驗。并設(shè)PC 和NC，結(jié)果見表5?？梢?，泊沙康唑質(zhì)量濃度不超過0.833 mg/mL 時不影響內(nèi)毒素與鱟試劑反應(yīng)。

表5 供試品干擾預(yù)試驗Ⅱ結(jié)果Tab.5 Results of the pre-interference test Ⅱ

2.6 溶劑處理供試品的內(nèi)毒素回收干擾驗證試驗

取泊沙康唑0.5 g，精密稱定，加入5.0 mLN，N-二甲基甲酰胺溶解配制成100 mg/ mL 的溶液，加BET用水逐步稀釋成質(zhì)量濃度為0.833 mg/mL 的泊沙康唑溶液；另取100 mg/mL 的泊沙康唑N，N- 二甲基甲酰胺溶液1 mL，加入30 EU/mL 內(nèi)毒素溶液，用BET 用水稀釋制成內(nèi)毒素濃度為0.25 EU/mL，泊沙康唑質(zhì)量濃度為0.833 mg/mL的溶液（2λ），后用同濃度的泊沙康唑溶液逐級稀釋為分別含0.125，0.06，0.03 EU/mL 細(xì)菌內(nèi)毒素的泊沙康唑溶液，同時配制含相同濃度內(nèi)毒素的水溶液進行試驗，試驗時N，N-二甲基甲酰胺濃度控制在2%及以下。結(jié)果顯示，N，N-二甲基甲酰胺在該濃度下對供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素?zé)o干擾作用。結(jié)果見表6。

表6 細(xì)菌內(nèi)毒素回收干擾驗證試驗結(jié)果Tab.6 Results of the verification test of bacterial endotoxin recovery interference test

2.7 正式干擾試驗［10-12］

取3 個批次的泊沙康唑適量，制得0.833 mg/ mL供試品溶液，并進行正式干擾試驗。結(jié)果見表7?？芍?，該濃度下供試品對2 個廠家的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的反應(yīng)均無明顯干擾，可進行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

表7 供試品干擾試驗結(jié)果Tab.7 Results of the interference test of samples

2.8 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

將3個批次的泊沙康唑稀釋后，進行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。結(jié)果均符合內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，見表8。

表8 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab.8 Results of BET of the samples

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素屬外源性熱原，具有致熱性，普遍存在于自然界中。人和動物對內(nèi)毒素有一定耐受力，但當(dāng)過量內(nèi)毒素進入血液后會引起機體嚴(yán)重的病理反應(yīng)，輕則致發(fā)熱、休克、心率過快，重則引起致命性敗血癥，并伴有多器官功能衰竭，甚至死亡。細(xì)菌內(nèi)毒素是制藥工業(yè)中最普遍和最主要的外源性熱原，制藥過程中細(xì)菌內(nèi)毒素超標(biāo)提示產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中可能存在某些風(fēng)險因素，控制了細(xì)菌內(nèi)毒素，相當(dāng)于控制了熱原污染。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查在制藥領(lǐng)域具有重要意義；如泊沙康唑注射液生產(chǎn)過程中，一般采用除菌過濾加終端滅菌的方式控制生產(chǎn)中的細(xì)菌內(nèi)毒素，而控制泊沙康唑原料內(nèi)毒素含量，有利于制劑生產(chǎn)工藝和質(zhì)量的過程控制。

由于泊沙康唑不溶于水，本研究中考察了采用N，N-二甲基甲酰胺溶解泊沙康唑原料藥后，用BET用水稀釋至一定質(zhì)量濃度，以建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。進行濃度預(yù)干擾試驗時，發(fā)現(xiàn)0.5%～2%N，N-二甲基甲酰胺對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾。同時考察了供試品的N，N-二甲基甲酰胺溶液中添加細(xì)菌內(nèi)毒素的回收驗證試驗，確認(rèn)用N，N-二甲基甲酰胺溶解供試品，對供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用。根據(jù)驗證結(jié)果，重新進行了泊沙康唑的預(yù)干擾試驗和正式干擾試驗，并對供試品進行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

本研究結(jié)果表明，泊沙康唑宜先用2%的N，N-二甲基甲酰胺溶解，再用BET用水制備質(zhì)量濃度≤0.833 mg/mL的供試品溶液，最后依照2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143方法進行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

綜上所述，本研究中建立的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法可行，可用于制劑生產(chǎn)中泊沙康唑原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素的控制。