何培迎，陳宏祥，仲春梅

(江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司，江蘇 新沂 221400)

氟環(huán)唑是一種內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，能抑制病菌麥角甾醇合成，阻礙病菌細(xì)胞壁的形成，并且氟環(huán)唑分子對(duì)一種真菌酶具有強(qiáng)力親和性，與目前已知?dú)⒕鷦┫啾龋軌蛴行б种汽溄晴薮己铣蒣1]。還可提高作物幾丁質(zhì)酶活性，導(dǎo)致真菌吸氣收縮，抑制病菌侵入，這是氟環(huán)唑在所有三唑類產(chǎn)品中獨(dú)一無二的特性。吡唑醚菌酯對(duì)病原真菌的線粒體呼吸具有抑制作用，即通過在細(xì)胞色素合成中阻止電子轉(zhuǎn)移抑制線粒體的呼吸，干擾細(xì)胞能量供給，使細(xì)胞死亡，從而發(fā)揮殺菌作用。對(duì)幾乎所有真菌類(子囊菌綱、擔(dān)子菌綱和半知菌類)病害都顯示出很好的活性。具有保護(hù)和治療作用，并有良好的滲透和內(nèi)吸作用[2]。

吡唑醚菌酯·氟環(huán)唑懸浮劑作為一種新型廣譜復(fù)配殺菌劑，對(duì)大田作物、水果、蔬菜的多種病害兼具治療、鏟除作用，尤其對(duì)小麥赤霉病、銹病的防治效果顯著、持效期長，對(duì)小麥安全，應(yīng)用前景廣闊。目前，關(guān)于氟環(huán)唑、吡唑醚菌酯以及其他復(fù)配制劑的檢測方法均有報(bào)道[3-6]，但有關(guān)17%吡唑醚菌酯·氟環(huán)唑復(fù)配制劑的高效液相色譜分析方法未見報(bào)道。本文建立的HPLC方法，以甲醇+0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相，采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱和可變波長紫外檢測器，對(duì)有效成分吡唑醚菌酯和氟環(huán)唑同時(shí)分離、定量。該方法可供檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)分析室人員監(jiān)督和把控吡唑醚菌酯·氟環(huán)唑復(fù)配制劑的質(zhì)量時(shí)作參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 島津高效液相色譜儀LC-20A，可變波長紫外檢測器，色譜工作站；甲醇(HPLC)；超純水制備系統(tǒng)；吡唑醚菌酯(99.0%)標(biāo)樣和氟環(huán)唑(99.0%)標(biāo)樣，國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(沈陽)。17%唑醚·氟環(huán)唑懸浮劑。

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18不銹鋼柱(250mm×4.6mm，粒徑5μm)；檢測波長235nm，流動(dòng)相：ψ(甲醇+0.2%磷酸水溶液)=75+25；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣體積10μL；柱溫：室溫(溫差變化≤2℃)；保留時(shí)間：氟環(huán)唑約6.9min；吡唑醚菌酯約9.5min(圖1、圖2)。

圖1 吡唑醚菌酯和氟環(huán)唑?qū)φ掌犯咝б合嗌V圖

圖2 17%吡唑醚菌酯·氟環(huán)唑懸浮劑試樣高效液相色譜圖

1.3 測定步驟

1.3.1 標(biāo)樣溶液配制 在50mL容量瓶中，稱取0.06g吡唑醚菌酯標(biāo)樣、氟環(huán)唑標(biāo)樣0.03g(均精確至0.000 1g)置于同一50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。用移液管準(zhǔn)確吸取上述溶液5mL，置于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾(0.45μm微孔濾膜)，濾液備用。

1.3.2 試樣溶液的配制 稱取0.5g被試物(精確至0.000 1g)置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。用移液管準(zhǔn)確吸取上述溶液5mL，置于50mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾(0.45μm微孔濾膜)，濾液待測。

1.3.3 測定 當(dāng)儀器基線穩(wěn)定后，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，使標(biāo)樣溶液連續(xù)進(jìn)樣，直至相鄰2針吡唑醚菌酯(或氟環(huán)唑)峰面積的相對(duì)變化<1.2%后，再按照標(biāo)樣溶液、被試物溶液、被試物溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。

1.3.4 計(jì)算 將試驗(yàn)測得的2針被試物溶液以及前后2針標(biāo)樣溶液中吡唑醚菌酯(或氟環(huán)唑)的峰面積分別進(jìn)行平均。被試物中吡唑醚菌酯(或氟環(huán)唑)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω(%)按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

A1——標(biāo)樣溶液中，吡唑醚菌酯(或氟環(huán)唑)峰面積的平均值；

A2——試樣溶液中，吡唑醚菌酯(或氟環(huán)唑)峰面積的平均值；

m1——吡唑醚菌酯(或氟環(huán)唑)標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2——試樣的質(zhì)量，g；

ω——標(biāo)樣中吡唑醚菌酯(或氟環(huán)唑)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 色譜分離條件選擇 試驗(yàn)過程中，反復(fù)比對(duì)被試物吡唑醚菌酯和氟環(huán)唑與標(biāo)樣在波長190～400nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜曲線，同時(shí)考慮溶劑峰、雜質(zhì)峰干擾以及各組分的靈敏度、分離度和數(shù)據(jù)穩(wěn)定性，最終確定最適檢測波長為235nm。

2.1.2 色譜柱及流動(dòng)相的選擇 為保證快速檢測有效成分吡唑醚菌酯和氟環(huán)唑且峰形良好，選擇150mm×4.6mm：Agilent ZORBAX XDB-C18不銹鋼柱和250mm×4.6mm：AgilentEclipse XDB-C18不銹鋼柱分別進(jìn)行研究，采用不同比例的甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相，均未得到良好的分離度。經(jīng)分析比較，發(fā)現(xiàn)在酸性條件下被測組分相對(duì)穩(wěn)定。添加不同濃度的冰乙酸和磷酸，最終選擇250mm×4.6mm AgilentEclipse XDB-C18不銹鋼柱，并采用磷酸作為減尾劑，確定流動(dòng)相為甲醇+0.2%磷酸水溶液(體積比75+25)，流量為1.0mL/min。該測定保留時(shí)間適中，實(shí)現(xiàn)吡唑醚菌酯和氟環(huán)唑的有效分離，且峰形良好。

2.2 線性相關(guān)性 配制不同質(zhì)量濃度的標(biāo)樣溶液，在優(yōu)化的色譜分離條件下進(jìn)行測定。橫坐標(biāo)為吡唑醚菌酯(氟環(huán)唑)的質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為其峰面積值。二者線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：Y吡唑醚菌酯(氟環(huán)唑)=1E+08x，r=0.999。吡唑醚菌酯定量線性關(guān)系在0.1～0.6mg/mL質(zhì)量濃度下良好；氟環(huán)唑定量線性關(guān)系在0.02～0.25mg/mL質(zhì)量濃度下良好結(jié)果，(圖3、圖4)。

圖3 吡唑醚菌酯線性關(guān)系圖

圖4 氟環(huán)唑線性關(guān)系圖

2.3 方法的精密度 試驗(yàn)采用5批次的被試物17%吡唑醚菌酯·氟環(huán)唑懸浮劑，連續(xù)重復(fù)測定5次，研究了定量分析方法的精密度，結(jié)果(表1)。吡唑醚菌酯和氟環(huán)唑的變異系數(shù)分別是0.65%和0.51%，滿足被試物定量分析的要求。

表1 精密度測定

2.4 方法的準(zhǔn)確度 試驗(yàn)采用產(chǎn)品空白制劑中添加不同濃度的吡唑醚菌酯和氟環(huán)唑標(biāo)樣的方法，配制5份與被試物相近的模擬樣品，開展添加回收率試驗(yàn)，研究方法的準(zhǔn)確度。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表面吡唑醚菌酯添加回收率為99.70%～99.96%，氟環(huán)唑添加回收率為99.20%～99.78%，兩者平均回收率分別為99.78%和99.45%(表2)，準(zhǔn)確度較高，可以滿足定量分析要求。

表2 準(zhǔn)確度測定數(shù)據(jù)

2.5 特異性鑒定 按照1.3.1/1.3.2所述方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，在1.2操作條件下采用HPLC-DAD峰純度分析法對(duì)氟環(huán)唑、吡唑醚菌酯進(jìn)行鑒別，特異性典型譜圖(圖5、圖6)。由譜圖可知，氟環(huán)唑、吡唑醚菌酯在該分析方法下對(duì)紫外光有較強(qiáng)的吸收信號(hào)。從色譜圖可以清晰的看出，有效成分氟環(huán)唑、吡唑醚菌酯處無其他物質(zhì)干擾，符合定量分析要求。

圖5 氟環(huán)唑特異性鑒定

圖6 吡唑醚菌酯特異性鑒定

2.6 非分析物干擾的判定 在評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度時(shí)，需要包含非分析物質(zhì)干擾試驗(yàn)，因?yàn)橹鷦┲械娜魏胃蓴_物均會(huì)導(dǎo)致分析方法出現(xiàn)系統(tǒng)偏差，分析時(shí)同時(shí)測定不帶助劑的原藥和空白樣品，證明其無相互干擾，并提交相關(guān)色譜圖。通過不加助劑的原藥色譜圖和空白樣品色譜圖判定，非分析物對(duì)有效成分氟環(huán)唑、吡唑醚菌酯的分析不構(gòu)成干擾，相關(guān)非分析物質(zhì)干擾典型譜圖(圖7～圖9)。

圖7 空白樣品圖8 氟環(huán)唑

圖9 吡唑醚菌酯

3 結(jié)論

綜上，本文建立的HPLC分析方法，保留時(shí)間合理，精密度與準(zhǔn)確度較高，可快速分離及測定吡唑醚菌酯·氟環(huán)唑制劑中兩種有效成分的含量，且線性相關(guān)性好，適用于檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)分析室對(duì)吡唑醚菌酯·氟環(huán)唑復(fù)配制劑質(zhì)量的監(jiān)督與把控。