高麗 楊丹丹

(1.云南省傳染病醫(yī)院/云南省艾滋病關(guān)愛中心，昆明 650301；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500；3.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明 650500)

新生隱球菌感染是全世界艾滋病患者死亡的主要原因，尤其是在撒哈拉以南非洲地區(qū)發(fā)病率最高[1]。新生隱球菌除了容易感染HIV個體外，還易感染其他免疫功能低下的個體，如造血系統(tǒng)惡性腫瘤、器官移植后服用免疫抑制劑及免疫缺陷病患者。格特隱球菌主要侵犯免疫功能正常的個體，但也感染免疫功能低下患者如合并艾滋病毒的患者[2]。

隱球菌病是結(jié)合臨床表現(xiàn)以及實驗室檢查確診。臨床上治療藥物包括兩性霉素B、三唑類抗真菌藥物和氟胞嘧啶。因而隱球菌病越來越受到臨床醫(yī)生的關(guān)注，現(xiàn)就新生隱球菌的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 新生隱球菌的致病機制和血清型

新生隱球菌感染人體主要通過呼吸道和皮膚侵入，由菌體和莢膜組成，莢膜是主要的致病因子。體外隱球菌無莢膜包裹，隨塵埃被吸入呼吸道內(nèi)，進入肺泡在細胞內(nèi)的高爾基體合成莢膜多糖，再由囊泡運輸至胞外與質(zhì)膜融合形成莢膜。帶莢膜的菌體在穿越上皮細胞和內(nèi)皮細胞屏障時與上皮細胞結(jié)合使細胞緊密結(jié)構(gòu)斷裂及骨架改變，產(chǎn)生跨細胞作用，穿越腦微血管內(nèi)皮細胞。早期認為帶莢膜的隱球菌才具有致病性，且莢膜的薄厚與致病性呈正相關(guān)。但近期通過電子顯微鏡觀察顯示，無莢膜或小莢膜菌株侵入內(nèi)皮細胞的能力強于大莢膜菌株，莢膜越小的細胞穿透力越強，莢膜大小與隱球菌毒力呈負相關(guān)[3,4]。新生隱球菌的菌體經(jīng)肺部通過血液循環(huán)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有嗜神經(jīng)組織性，且可透過血腦屏障，在腦脊液中生長繁殖，導(dǎo)致新生隱球菌性腦膜炎。此病可見于任何年齡，常常隱匿起病，亞急性或慢性病程，緩慢進展，逐漸加重。新生隱球菌在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，以腦膜炎最為常見。初期可有上呼吸道感染或肺部感染史，主要表現(xiàn)為逐漸加重的頭痛、且頭痛劇烈、發(fā)熱、惡心、嘔吐、腦膜刺激征、面癱、聽力障礙、視力下降、聽力減退、甚至失明、耳聾，隨著病情的進展加重，可表現(xiàn)出意識障礙、精神障礙、癲癇、癱瘓、持續(xù)性高熱。進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的隱球菌莢膜多糖的累積使腦脊液(CSF)的黏性增高，形成微生物栓子，阻礙蛛網(wǎng)膜顆粒和淋巴管中CSF的重吸收[5]，導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，上述癥狀和高顱壓密切相關(guān)，也可導(dǎo)致患者因腦疝死亡。

2 實驗室檢查

目前診斷隱球菌感染首先通過一般實驗室檢查和影像學(xué)檢查進行初步篩查，再以檢測隱球菌抗原抗體的免疫學(xué)檢查進行診斷，而病理診斷仍為目前診斷隱球菌感染的金標準。分子生物學(xué)技術(shù)可對隱球菌進行基因分型等。但我們目前缺乏對隱球菌早期感染的特異性診斷方法，常導(dǎo)致臨床隱球菌感染的漏診。

2.1 病原體檢查

墨汁染色法 迅速、簡便、可靠。根據(jù)感染部位不同取所需檢查的新鮮標本，如腦脊液、痰液、病灶組織或滲液等(腦脊液應(yīng)離心后取沉淀涂片)，置于玻片上，加墨汁1滴，覆以蓋玻片，在顯微鏡暗視野下找隱球菌，可見圓形菌體，外軸有一圈透明的肥厚莢膜，內(nèi)有反光孢子，但無菌絲。在臨床工作中，主要以腦脊液送檢為主，痰液、糞便、胸腹水等也有檢出。

真菌培養(yǎng) 取標本少許置于沙堡弱培養(yǎng)基中，在室溫或37℃培養(yǎng)3～4 d可見菌落長出。

2.2 血清學(xué)檢查

由于患者血清中可測到的抗體不多，因此檢測抗體陽性率不高，特異性不強，僅作輔導(dǎo)診斷。通常檢測新生隱球菌莢膜多糖抗原，以乳膠凝集試驗敏感而特異，且有估計預(yù)后和療效的作用。

現(xiàn)在乳膠凝集試驗方法的很多產(chǎn)品因為無證而在臨床中的應(yīng)用受到了限制，如今更多的實驗室采用的是新生隱球菌莢膜多糖檢測試劑盒(ELISA)。

目前用于臨床的隱球菌實驗室檢查主要分為病原學(xué)涂片和培養(yǎng)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢測方法。分子生物學(xué)技術(shù)在隱球菌分類、基因分型和診斷等研究中發(fā)展迅速，如染色體脈沖電泳、核酸探針技術(shù)、DNA指紋分類、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以及PCR結(jié)合其他技術(shù)等方法。

3 新生隱球菌在國內(nèi)、外的研究現(xiàn)狀

新生隱球菌感染是艾滋病患者常見的一種機會性感染，隱球菌的感染影響了艾滋病的疾病進程，隱球菌的多樣性導(dǎo)致了HIV感染者治療的難度，增加了HIV感染者的死亡率。在免疫缺陷的患者特別是HIV感染者中，腦膜炎的一個致命原因是隱球菌病，特別是在非洲和亞洲東南部，比起歐洲和北美，艾滋病相關(guān)的隱球菌病更常見[6]。對于健康人群來說，隱球菌性腦膜炎的發(fā)病率為0.15%，而對于艾滋病患者其發(fā)病率可高達6.5%[7]，也有資料表明，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[8]。在墨西哥，艾滋病患者中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是機會性感染的第二大原因[9]。在不同地理區(qū)域的艾滋病患者中，隱球菌性腦膜炎仍然具有較高的死亡率[10，11]。

針對血清學(xué)分型、基因型分型及藥敏試驗方面，國內(nèi)、外的同行也做了大量的研究工作。

血清學(xué)方面 新生隱球菌按血清學(xué)可分為A、B、C、D及AD5個血清型，包括3個變種：格魯比變種(血清型A)；新生變種(血清型D、AD)；格特變種(血清型B、C)。血清型A、D和AD在世界范圍內(nèi)廣泛分布，主要感染免疫缺陷人群(尤其是艾滋病患者)，血清D型較少引起隱球菌病，并且其中一些病例是由AD雜合體引起的[12]。1986年，Michael[13]自24例艾滋病并發(fā)新生隱球菌的病例中，將其證實為A、D或AD型。1987年，李竹青等[14]對中國致病性新生隱球菌血清型進行了研究，并得出結(jié)論，A型占大多數(shù)，有部分B型，D型、AD型及U型(不能分型)少見，無C型。血清型B和C，主要感染免疫正常的人群，主要分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)的澳大利亞、亞洲、南非、加利福尼亞南部和歐洲南部，但自1999年以來，在加拿大英屬哥倫比亞的Vancouver島出現(xiàn)格特變種的爆發(fā)流行[15]。2015年，邊富寧等[16]對廣西貴港地區(qū)2009—2012年20株新生隱球菌進行血清學(xué)分析，20株有19株為新生隱球菌格魯比變種，血清型為A型，a交配型，基因型為VNⅠ型。1株為格特隱球菌，屬a交配型，基因型VGⅠ。

基因型方面 新生隱球菌有8種主要的基因型，即VNⅠ-VN Ⅳ和VGⅠ-VGⅣ，對應(yīng)關(guān)系為VNⅠ和VNⅡ為格魯比變種；VN Ⅲ為格魯比變種和新生變種雜合體，VN Ⅳ為新生變種；VGⅠ-VG Ⅳ為格特隱球菌。而艾滋病患者合并隱球菌感染主要由新生變種和格魯比變種引起。

2013年，戚建明等[17]對129株新生隱球菌基因型及感染人群進行研究，經(jīng)過PCR(polymerase chain reaction)指紋分析和多位點序列分型(MLST，multilocus sequence typing)分析得到基因分型結(jié)果，新生隱球菌主要條帶為VNⅠ型，但次要條帶不同于已知VNⅠ各亞型，屬于一種新的亞型，將其命名為VNⅠc。同年，Khayhan等[18]對中國86株新生隱球菌菌種結(jié)構(gòu)的研究顯示，中國華北、華東地區(qū)的新生隱球菌臨床株以ST5型為主。2016年，郭鵬豪等[19]對廣東地區(qū)25株新生隱球菌多位點序列分型，經(jīng)過MLST分析顯示，主要型別也為ST5型。經(jīng)同源性比對，24株為VNⅠ型。2015年，Maestrale等[20]對引起腦膜炎的新生隱球菌和格特隱球菌變種進行基因和病理特征方面進行研究，經(jīng)過多位點系列分析表明，格特隱球菌的基因型為AFLP4/VGⅠ，新生隱球菌的基因型為AFLP2/VNⅣ。

云南地區(qū)隱球菌的患者不在少數(shù)，卻并沒有臨床分離株血清型、基因型相關(guān)研究的報道。云南地區(qū)新生隱球菌的研究主要如下：

2011年，張嗣興等[21]對云南省傳染病醫(yī)院的艾滋病合并新生隱球菌患者耐藥性研究表明，新生隱球菌對AMB和5FC非常敏感。

2014年、2016年，陶星辰等[22,23]對云南省大理、昭通、曲靖、臨滄4個地區(qū)鴿糞中新生隱球菌的分離與鑒定結(jié)果表明，云南省地區(qū)鴿糞中新生隱球菌帶菌率較高，且不同地區(qū)帶菌率不同，并對新生隱球菌格魯比變種進行微衛(wèi)星分型分析。

2015年，張米等[24]對云南省傳染病醫(yī)院分離得到的155株新生隱球菌的藥敏結(jié)果統(tǒng)計得到，新生隱球菌對兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑的耐藥率分別為0.6%、7.0%、9.6%。

2019年，樊紅麗等[25,26]對艾滋病患者分離的新生隱球菌的藥物敏感性以及云南省新生隱球菌的藥物敏感流行病學(xué)折點進行了研究，發(fā)現(xiàn)在6種抗真菌藥物中，新生隱球菌對伏立康唑和兩性霉素B的耐藥率為1.32%，5-氟胞嘧啶的耐藥率為0.33%，未發(fā)現(xiàn)對伊曲康唑和氟康唑產(chǎn)生耐藥的菌株；從云南省3家獨立的實驗室中共分離出324株新生隱球菌，其對6種常用抗真菌藥物的流行病學(xué)折點為5-氟胞嘧啶8 μg/mL，泊沙康唑0.25 μg/mL，伏立康唑0.12 μg/mL，伊曲康唑0.25 μg/mL，氟康唑16 μg/mL，兩性霉素B1 μg/mL。

我院雖然每年都能檢出隱球菌臨床分離株40株左右，但是目前的研究僅停留在分離鑒定及藥物敏感性分析試驗，這就要求咱們的工作人員能夠更好地開展隱球菌的基礎(chǔ)性研究。

4 展 望

我院作為艾滋病患者的定點收治醫(yī)療機構(gòu)及全國首家省級艾滋病關(guān)愛中心，是衛(wèi)生部艾滋病臨床培訓(xùn)基地，開展全省艾滋病臨床醫(yī)生培訓(xùn)。在臨床治療過程中，艾滋病合并隱球菌病患者以顱壓高、頭痛為主要特征，也不排除同時患有隱球菌肺病，同時在診治過程中發(fā)現(xiàn)隱球菌的復(fù)發(fā)率較高，根治率有待提高。

作為傳染病醫(yī)院的醫(yī)生在收治艾滋病患者的同時，如患者有頭痛、不明原因發(fā)熱等相關(guān)癥狀一定要考慮隱球菌感染，反復(fù)多次送檢相關(guān)標本(如腦脊液、痰液、胸腹水、糞便等)，確保送檢的每一份樣本符合送檢要求以提高陽性率。

作為微生物實驗室的工作人員，一定要具有相當高的敏銳性，對送檢的每一份標本均要以陽性看待，在做好自己防護的同時，積極改進方法、積累經(jīng)驗，提高陽性檢出率，為臨床早發(fā)現(xiàn)、早治療提供依據(jù)。