武玉露，夏玲珍，王佳玲，成 騁，何冰芳,

(1. 南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800； 2. 臺(tái)州市中心醫(yī)院(臺(tái)州學(xué)院附屬醫(yī)院),浙江 臺(tái)州 318000； 3. 南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

腫瘤壞死因子α(TNFα)最初被鑒定為導(dǎo)致小鼠中可移植腫瘤快速壞死的因子，現(xiàn)在它被認(rèn)為是參與先天免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的多功能細(xì)胞因子[1-2]。TNFα發(fā)揮許多重要的生理和病理作用:TNFα通過與腫瘤細(xì)胞表面的TNFα受體結(jié)合而引起腫瘤細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡；TNFα是急性和慢性系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，TNFα不僅誘導(dǎo)其自身分泌，而且還刺激其他炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生[3]。此外，TNFα在自身免疫疾病中起重要作用，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病(包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎)、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和系統(tǒng)性硬化癥[4]。TNFα已成為腫瘤發(fā)生，腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要危險(xiǎn)因素，是癌癥相關(guān)慢性炎癥的關(guān)鍵中介。因此，TNFα是一種具有潛力的應(yīng)用于抗腫瘤、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)的生物制劑[5-6]。大腸桿菌(E.coli)[7-10]、畢赤酵母(Pichiapastoris)[11]和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)[12-13]等表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于重組TNFα的表達(dá)研究。在這些表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌是重組TNFα生產(chǎn)的主要宿主，因其具有遺傳背景清晰、生長(zhǎng)周期短、操作簡(jiǎn)便、培養(yǎng)成本低、表達(dá)系統(tǒng)成熟穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)[14]。但外源蛋白在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)存在一些問題：在細(xì)胞質(zhì)中存在大量雜蛋白質(zhì)而導(dǎo)致后續(xù)純化工藝的復(fù)雜性與產(chǎn)量的降低[15]；過表達(dá)可導(dǎo)致包涵體的形成[16]，而包涵體體外復(fù)性可能會(huì)帶入一些復(fù)性劑對(duì)活性的影響。

大腸桿菌的內(nèi)外膜雙層膜結(jié)構(gòu)之間的區(qū)域即所謂的周質(zhì)空間。E.coli的細(xì)胞周質(zhì)中含有一系列氧化還原酶及二硫鍵異構(gòu)酶，生物體獨(dú)特的氧化還原環(huán)境有利于二硫鍵的正確形成，幫助蛋白正確折疊，提高活性蛋白的表達(dá)水平；與細(xì)胞質(zhì)中相比，周質(zhì)空間的蛋白酶活性更低，可減少目的蛋白的胞內(nèi)降解從而使其穩(wěn)定存在。利用定向釋放技術(shù)釋放周質(zhì)蛋白，使細(xì)胞外膜破損而不損害細(xì)胞內(nèi)膜，可減少宿主菌蛋白的污染，簡(jiǎn)化重組蛋白下游純化工藝[15]。

在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)外源蛋白可溶性表達(dá)的常用工具和有效手段是融合標(biāo)簽技術(shù)，主要是將其與目的蛋白基因連接以介導(dǎo)目的蛋白的可溶性表達(dá)和純化。本課題組篩選到來源于阿氏節(jié)桿菌(Arthrobacterarilaitensis)NJEM01的β-呋喃果糖苷酶(β-Ffase)，該酶在大腸桿菌中能夠高效分泌表達(dá)，N末端含有53個(gè)氨基酸殘基組成的自身信號(hào)肽，具有強(qiáng)的折疊和分泌能力等特性。課題組前期工作中將其高度可溶且穩(wěn)定的截短體開發(fā)成一種新型的融合標(biāo)簽Ffu，Cheng等[17]利用該融合標(biāo)簽融合一些難以表達(dá)的外源蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)甚至胞外表達(dá)。

本研究的目的是篩選幾種融合標(biāo)簽Ffu與目標(biāo)蛋白TNFα形成重組蛋白，介導(dǎo)TNFα分泌至大腸桿菌周質(zhì)空間中。另選取兩種常用的增溶性融合標(biāo)簽MBP和NusA用來評(píng)估Ffu標(biāo)簽的增溶效果；通過對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化來提高重組蛋白Ffu-TNFα的可溶性和產(chǎn)量，采用滲透壓休克和溶菌酶法研究Ffu標(biāo)簽介導(dǎo)TNFα在大腸桿菌中異源表達(dá)的細(xì)胞定位，采用Western blotting和MTT 法檢測(cè)重組蛋白Ffu-TNFα的抗原性和細(xì)胞毒活性，以期獲得高效可溶性表達(dá)且具有生物活性的重組腫瘤壞死因子α。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體pFfu、表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)、小鼠成纖維癌細(xì)胞L929，何冰芳教授實(shí)驗(yàn)室保存。

各種內(nèi)切酶、T4連接酶，TaKaRa公司；DNA回收、質(zhì)粒提取試劑盒，Axygen公司；Anti-TNF alpha鼠源單抗，Proteintech(武漢)公司；HRP2羊抗鼠抗體，正能公司。

PCR引物及編碼人TNFα的基因均由金唯智生物科技有限公司(蘇州)合成。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以構(gòu)建好的包含新型融合標(biāo)簽Ffu的質(zhì)粒pFfu用于表達(dá)人源TNFα。將全基因合成的人源TNFα(構(gòu)建在pUC57質(zhì)粒中)作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。含有不同融合標(biāo)簽的質(zhì)粒pFfu209和pFfu217用NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收并純化擴(kuò)增后的目的片段及質(zhì)粒載體基因片段，以T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入宿主菌E.coliBL21(DE3)中，在含有卡那霉素(50 mg/mL)的LB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取重組子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將陽性重組子測(cè)序。所涉及的相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作方法參照文獻(xiàn)[18]。

1.2.2 融合標(biāo)簽的選擇及重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化

將含有表達(dá)載體pFfu209-TNFα、pFfu217-TNFα的重組菌，接種至含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)90 min，當(dāng)OD600為0.6～0.8時(shí)加0.5 mmol/L IPTG，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h。收集菌體，在1 mmol/L PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)、20 mmol/L Tris-HCl緩沖(pH8.0)中超聲破碎，用冷凍離心機(jī)(5424R型，Eppendorf公司)離心(12 000 r/min，20 min，4 ℃)，收集破碎上清及破碎沉淀，SDS-PAGE分析表達(dá)結(jié)果。分析各標(biāo)簽對(duì)TNFα的增溶效果，選擇表達(dá)效果較好的重組蛋白，分別從誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)表達(dá)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間上進(jìn)行優(yōu)化。分析重組蛋白的表達(dá)情況，以得到較優(yōu)的表達(dá)條件。

1.2.3 重組蛋白的細(xì)胞定位

分別應(yīng)用滲透壓休克法和溶菌酶法定向釋放大腸桿菌周質(zhì)蛋白。滲透壓休克法是參照文獻(xiàn)[19]的方法將培養(yǎng)物分離成周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)部分。取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min，離心2 min，得菌體；用1 mL高滲緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的蔗糖，pH 9.0)重懸菌體，室溫放置30 min，離心棄上清，再加入1 mL低滲緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，冰上放置20 min，離心，所得上清即為周質(zhì)蛋白。

溶菌酶法是根據(jù)French等[20]的方法將1 mL培養(yǎng)物以3 000g離心20 min，將沉淀重懸于1 mL破碎緩沖溶液(0.5 mg/mL的雞蛋清溶菌酶、200 mmol/L Tris、500 mmol/L蔗糖、1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中?；鞈乙罕戏胖?5 min，15 000g離心30 min，所得上清即為周質(zhì)空間中的蛋白。

1.2.4 重組蛋白的純化

通過軟件ExPASY在線預(yù)測(cè)重組蛋白Ffu209-TNFα的理論pI值約為5.64，使用DEAE-sepharose FF柱聯(lián)合AKTA Prime Plus System(GE Healthcare Life Science Inc.)進(jìn)行陰離子交換色譜層析。選擇pH為6.5的平衡緩沖與洗脫緩沖液。固相載體用平衡緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4，pH 6.5)平衡，將5 mL蛋白樣品以0.5 mL/min的流速加入，再平衡；洗脫緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4、1 mol/L NaCl，pH 6.5)以1 mL/min的流速在不同NaCl濃度下進(jìn)行梯度洗脫。收集各梯度濃度的洗脫液，進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白洗脫時(shí)所需的鹽濃度。透析法除鹽，選用合適分子量的透析袋，20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)作為置換緩沖，4℃透析過夜。BCA(bicinchoninic acid)法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.5 Western blotting鑒定重組蛋白的免疫原性

將純化得到的重組蛋白Ffu209-TNFα在12% SDS-PAGE 上分離，并轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后將膜在5%脫脂牛奶中室溫振搖封閉 1 h。將膜加到用封閉液稀釋的抗TNFα一抗溶液中4 ℃孵育過夜，TBST (TBS+Tween)洗滌 3 遍(每次10 min)后加入 HRP 標(biāo)記的二抗(用封閉液稀釋)，室溫孵育 2 h，TBST 洗滌3遍(每次10 min)。將膜上水分吸干，加入顯色液，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)系統(tǒng)(GE Healthcare Life Science Inc)顯影。

1.2.6 重組蛋白Ffu209-TNFα的體外細(xì)胞毒活性

L929細(xì)胞于DMEM-10%(體積分?jǐn)?shù))FBS，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。將 L929 細(xì)胞傳于96孔板(105個(gè)/孔)，37 ℃、5% CO2貼壁生長(zhǎng)24 h后小心棄培養(yǎng)基，每孔加入100 mL待測(cè)樣品，樣品溶于含放線菌素D的DMEM-10%FBS(放線菌素D的終質(zhì)量濃度為1 μg/mL)，每個(gè)樣品設(shè)5個(gè)平行點(diǎn)，37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)18 h。每孔加入20 μL MTT (5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。小心棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，搖床上低速混勻。測(cè)定490 nm處的A490值。細(xì)胞存活率計(jì)算見式(1)。

細(xì)胞存活率=[(A490Ffu-TNFα-A490空白)/
(A490對(duì)照-A490空白)]×100%

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建

為了設(shè)計(jì)合適片段長(zhǎng)度的Ffu標(biāo)簽利于融合表達(dá)載體的構(gòu)建，不同長(zhǎng)度Ffase截短體的可溶性進(jìn)行了預(yù)測(cè)使用了修正后的Wilkinson和Harrison法[17]，根據(jù)Ffase截短體的氨基酸序列、蛋白分子量和等電點(diǎn)信息，預(yù)測(cè)了相應(yīng)的Ffase截短體蛋白可溶性數(shù)據(jù)?；谠咏?jīng)濟(jì)性原則，結(jié)合初步的截短體可溶性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇了分子量大小適中，可溶性高的β-FFase截短體，即Ffu209和Ffu217，融合標(biāo)簽Ffu209、Ffu217的部分特征分析見表1。由表1可知：截短體Ffu209和Ffu217的親水性平均值(GRAVY)較低，表明它們具有較高的親水性。MBP和NusA是最常用來提高融合蛋白溶解度且增溶性較好的融合標(biāo)簽。相比較于MBP和NusA而言,Ffu融合標(biāo)簽具有分子量適中、親水性較強(qiáng)并且自身具有極好的可溶性且穩(wěn)定等特性。由此可見Ffu標(biāo)簽的這些特征使其有望開發(fā)成很有潛力的融合標(biāo)簽。本研究中，選擇MBP和NusA作為對(duì)照組來比較Ffu融合標(biāo)簽的增溶能力。

表1 Ffu融合標(biāo)簽的特征

將全基因合成的人源TNFα與含有不同融合標(biāo)簽的質(zhì)粒pFfu209、pFfu217、pMAL-MBP和pET/NusA酶切后，用T4 DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒pFfu209-TNFα、pFfu217-TNFα、pMAL-MBP-TNFα和pET/NusA-TNFα，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖1。由圖1可知：pFfu重組子基因長(zhǎng)度分別是1 400、1 500 bp左右，與理論值一致；pMAL-MBP-TNFα和pET/NusA-TNFα使用對(duì)應(yīng)引物顯示目的基因長(zhǎng)度為700 bp左右。重組子的陽性單菌落經(jīng)測(cè)序后結(jié)果顯示目的基因成功地克隆到表達(dá)載體中。結(jié)果表明成功構(gòu)建了融合表達(dá)TNFα的重組菌E.coliBL21(DE3)/pFfu209-TNFα、E.coliBL21(DE3)/pFfu217-TNFα、E.coliBL21(DE3)/pMAL-MBP-TNFα和E.coliBL21(DE3)/pET/NusA-TNFα。

(a)：1～3—重組子pFfu209-TNFα,4～6—重組子pFfu217-TNFα；(b)：1～3—重組子pMAL-MBP-TNFα,4～6—重組子pET/NusA-TNFα。M—標(biāo)準(zhǔn)DNA圖1 重組子菌落的鑒定Fig.1 Identification of recombinant colonies

2.2 重組融合蛋白的選擇

pFfu209-TNFα、pFfu217-TNFα、pMAL-MBP-TNFα和pET/NusA-TNFα重組表達(dá)載體，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)、25 ℃培養(yǎng)6 h后分別分析細(xì)胞破碎液上清液(可溶性)以及細(xì)胞破碎液沉淀(包涵體)，結(jié)果如圖2所示。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；S—可溶性組分；ib—包涵體沉淀圖2 融合標(biāo)簽對(duì)TNFα在大腸桿菌中表達(dá)的影響Fig.2 Effect of fusion tags on the expression of TNFα in E. coli

由圖2可見：所選的2種Ffu融合標(biāo)簽分別介導(dǎo)TNFα在大腸桿菌中成功表達(dá)且不同程度地提高了TNFα的可溶性表達(dá)；相對(duì)而言，F(xiàn)fu209標(biāo)簽對(duì)TNFα的增溶效果較好且表達(dá)量高，幾乎沒有包涵體產(chǎn)生；MBP標(biāo)簽在提高融合蛋白的可溶性同時(shí)會(huì)產(chǎn)生較多的包涵體；NusA標(biāo)簽在提高TNFα總體表達(dá)水平上也較有效。然而，分子量較大的融合標(biāo)簽對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生更大的代謝負(fù)擔(dān)，而且可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)融合蛋白可溶性和總體表達(dá)量過于樂觀的評(píng)估[21-22]。NusA標(biāo)簽分子量大小為5.45×104，F(xiàn)fu209標(biāo)簽的分子量為1.76×104，約為NusA分子量的1/3。因此，F(xiàn)fu209標(biāo)簽對(duì)細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)遠(yuǎn)低于NusA。同時(shí)，考慮到原子經(jīng)濟(jì)學(xué)原則，故選取Ffu209作為融合標(biāo)簽進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化以得到更多的可溶性重組蛋白。

2.3 重組蛋白Ffu209-TNFα的誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化

對(duì)誘導(dǎo)溫度、IPTG的濃度、IPTG與乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)以及誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：重組蛋白Ffu209-TNFα在20 ℃、IPTG濃度為0.3 mmol/L、乳糖為1 g/L條件下聯(lián)合誘導(dǎo)，發(fā)酵24 h時(shí)，表達(dá)效果較優(yōu)。

SDS-PAGE分析該條件下重組蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果見圖4。由圖4可知：利用灰度掃描計(jì)算重組蛋白Ffu209-TNFα占總蛋白表達(dá)量的76%左右，其中可溶性組分占89%左右。此外，還可發(fā)現(xiàn)破碎上清與破碎沉淀中的目標(biāo)蛋白存在分子量上的高度差，這可能是由于融合標(biāo)簽Ffu的N末端含有一段53個(gè)氨基酸殘基的自身信號(hào)肽，在重組蛋白分泌至周質(zhì)空間表達(dá)時(shí)被剪切，由此產(chǎn)生了分子量的差異。

圖3 不同誘導(dǎo)條件對(duì)應(yīng)重組蛋白Ffu209-TNFα的表達(dá)量和可溶性比例Fig.3 Different induction conditions correspond to the expression level and soluble ratio of the recombinant protein Ffu209-TNFα

2.4 重組蛋白Ffu209-TNFα的細(xì)胞定位

分別采用滲透壓休克和溶菌酶法定向釋放大腸桿菌周質(zhì)空間蛋白，并以超聲破碎樣品為對(duì)照，結(jié)果見圖5。由圖5可知：滲透壓休克法和溶菌酶法均可釋放出目標(biāo)蛋白，證明融合標(biāo)簽Ffu可以幫助TNFα實(shí)現(xiàn)可溶性甚至周質(zhì)空間分泌表達(dá)。兩種方法提取的周質(zhì)空間蛋白中雜蛋白數(shù)量比超聲破碎中的雜蛋白低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，并且溶菌酶法提取的雜蛋白量更少，故在后續(xù)大量釋放周質(zhì)蛋白選取溶菌酶法，溶菌酶可以在下一步純化中除去。由此可知，使用新型融合標(biāo)簽Ffu可以基于質(zhì)粒pET的表達(dá)系統(tǒng)將TNFα分泌至大腸桿菌周質(zhì)中。TNFα含有2個(gè)半胱氨酸可以形成1個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，周質(zhì)空間中含有一系列氧化還原酶及二硫鍵異構(gòu)酶可以幫助二硫鍵正確折疊而更易獲得有生物活性的重組蛋白。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1—0.3 mmol/LIPTG誘導(dǎo)24 h后超聲破碎上清；2—超聲破碎沉淀圖4 SDS-PAGE分析重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)Fig.4 Analysis of recombinant protein expression in Escherichia coli by SDS-PAGE

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1—超聲破碎上清；2—溶菌酶法；3—滲透壓休克法圖5 SDS-PAGE分析不同方法提取周質(zhì)蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of different methods for extracting periplasmic proteins

2.5 重組蛋白的純化

將提取的周質(zhì)空間蛋白在陰離子交換色譜層析柱中分離，利用不同濃度的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，當(dāng)NaCl濃度為200 mmol/L時(shí)，目的蛋白被洗脫下來，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：獲得電泳純的重組融合蛋白Ffu209-TNFα，且灰度掃描得其純度達(dá)95%左右。BCA法測(cè)定純化后的重組蛋白濃度，計(jì)算得重組蛋白分泌到周質(zhì)空間中的產(chǎn)量達(dá)12 mg/L。已有多種融合標(biāo)簽應(yīng)用于幫助TNFα在大腸桿菌中高效表達(dá)，例如：Osaki等[7]構(gòu)建了抗體-細(xì)胞因子融合蛋白(Ia1-TNFa)，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)以可溶形式產(chǎn)生，產(chǎn)量達(dá)2 mg/L；Ma等[8]制備了由ACDCRGDCFCG肽融合TNFα組成的RGD-hTNFα，從大腸桿菌發(fā)酵菌體中獲得約18 mg/L的RGD-hTNFα；Dai等[23]構(gòu)建重組GST-TNFα融合蛋白原核表達(dá)載體，產(chǎn)量為0.466 mg/g。由此可見，融合標(biāo)簽Ffu可以幫助TNFα實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌周質(zhì)空間中以較高表達(dá)量來表達(dá)。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1—周質(zhì)蛋白；2—200 mmol/L NaCl的洗脫峰圖6 SDS-PAGE分析陰離子交換色譜純化周質(zhì)中 重組Ffu209-TNFα Fig.6 SDS-PAGE analysis of recombinant Ffu209-TNFα in the periplasm by anion exchange chromatography

2.6 Western blotting鑒定重組蛋白的免疫原性

為了確認(rèn)重組TNFα的性質(zhì)，使用抗TNFα抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果見圖7。由圖7可知：周質(zhì)空間蛋白組分中及純化洗脫峰中均有蛋白與抗TNFα抗體反應(yīng)，顯示的位置條帶大小與重組蛋白Ffu209-TNFα的預(yù)期值一致，結(jié)果說明利用融合標(biāo)簽Ffu在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了Ffu209-TNFα的周質(zhì)空間分泌表達(dá)，且陰離子交換色譜成功純化出重組Ffu209-TNFα。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1—周質(zhì)組分Ffu209-TNFα；2—純化后的Ffu209-TNFα圖7 Western blotting鑒定重組蛋白Ffu209-TNFα的 免疫原性Fig.7 Immunogenicity of the recombinant protein Ffu209-TNFα was identified by Western blotting

2.7 重組蛋白Ffu209-TNFα的生物學(xué)活性

用L929小鼠成纖維細(xì)胞通過測(cè)定重組蛋白Ffu209-TNFα的體外細(xì)胞毒活性，結(jié)果見圖8。以濃度值(以對(duì)數(shù)表示)作為自變量，細(xì)胞存活率作為因變量，并以50%的細(xì)胞毒活性作為活性單位(U)，計(jì)算得重組Ffu209-TNFα的體外細(xì)胞毒活性為3.47×105U/mg。由圖8可以看出：重組蛋白Ffu209-TNFα對(duì)L929細(xì)胞具有致死活性，并且致死率與Ffu209-TNFα濃度呈量效關(guān)系。在本研究中，周質(zhì)TNFα是可溶的，且具有生物活性。因此，融合標(biāo)簽Ffu209對(duì)TNFα的活性不具有明顯影響。Ma等[8]制備了由ACDCRGDCFCG肽融合人TNFα組成的RGD-hTNFhTNFα與RGD-hTNFα的體外比酶活分別為2.45×107和 4.15×107U/mg。Osaki等[7]構(gòu)建了抗體-細(xì)胞因子融合蛋白(Ia1-TNFa)，其生物活性比TNFα自身低7倍左右。Dai等[23]構(gòu)建重組GST-TNFα融合蛋白原核表達(dá)載體，細(xì)胞毒活性為1.82×105U/mg。Tsukamoto等[24]使用Trx A硫氧還蛋白在大腸桿菌中表達(dá)TNFα重組蛋白，重組TNFα的EC50為0.19 pmol/L。盡管我們已經(jīng)利用融合標(biāo)簽Ffu實(shí)現(xiàn)了TNFα在大腸桿菌周質(zhì)空間中有活性的表達(dá)，但是與標(biāo)準(zhǔn)TNFα蛋白相比其活性有所降低，可能是融合標(biāo)簽的存在影響到目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)功能與生物活性。融合標(biāo)簽Ffu存在一定的局限性，標(biāo)簽分子量較大，對(duì)較小分子量的蛋白活性可能會(huì)有一定的影響。

圖8 重組蛋白Ffu209-TNFα對(duì)L929的細(xì)胞毒活性(n=5)Fig.8 Cytotoxic activity of recombinant protein Ffu209-TNFα against L929 (n=5)

3 結(jié)論

利用新型標(biāo)簽Ffu得到了一個(gè)可以成功將TNFα高效可溶性表達(dá)分泌至大腸桿菌周質(zhì)空間中的系統(tǒng)，經(jīng)過誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，重組蛋白Ffu209-TNFα表達(dá)量占總蛋白表達(dá)量的76%左右，其中可溶性組分占89%左右，分泌至周質(zhì)空間表達(dá)量達(dá)到12 mg/L。對(duì)重組蛋白的免疫原性及生物活性進(jìn)行鑒定與檢測(cè)，表明融合標(biāo)簽Ffu對(duì)周質(zhì)的TNFα的正確折疊具有適當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)作用。為一些生物活性蛋白，尤其是含二硫鍵的活性蛋白，在大腸桿菌周質(zhì)空間表達(dá)提供了一個(gè)新的工具。