陳 思，徐 錚，李梁斐，李 莎，徐 虹

(1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院 材料化學(xué)與工程國家重點(diǎn)實驗室，江蘇 南京 211800；2.江蘇省先進(jìn)生物與化學(xué)制造協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 211800)

甘油葡萄糖苷(2-O-(α-D-glucopyranosyl)-sn-glycerol，αGG[1-2])，是一種糖苷化合物，由葡萄糖基和甘油基以糖苷鍵連接而成，是沙漠植物細(xì)胞在外界脅迫條件下合成的一種滲透壓調(diào)節(jié)劑(osmolyte)。它可以保護(hù)細(xì)胞免受高滲、高溫、干旱和紫外線等惡劣環(huán)境的破壞[3]。在日本清酒、味增和米醂中，也發(fā)現(xiàn)含有活性成分αGG[4-5]。由于低吸水性、高保濕性等特點(diǎn)，αGG可用作化妝品原料，提高皮膚保濕效果[6-7]。另外，αGG還是一種良好的化妝品添加劑，具有保濕、抗氧化和抗衰老等功效[8-9]，可以消除化妝品潔面后的皮膚緊繃感[10]。

海藻糖(Tre)是一種安全、可靠的天然糖類，它是由2個葡萄糖分子以1,1-糖苷鍵構(gòu)成的非還原性糖，有3種異構(gòu)體，并對多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用。卷柏作為一種復(fù)蘇植物，其抗氧化系統(tǒng)在復(fù)蘇過程中啟動其保護(hù)酶防御機(jī)制抵抗水分脅迫，而海藻糖在卷柏保護(hù)生物分子過程中發(fā)揮著重要作用[11]。因此，在本研究中，筆者將海藻糖與αGG對3種自由基的清除效果作對比，并建立紫外輻射對L929細(xì)胞的損傷模型，研究αGG對受紫外損傷細(xì)胞的保護(hù)及修復(fù)作用[12-13]，希望為αGG在抗衰老型化妝品領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

αGG(分析純，AR)，德國Bitop AG公司；海藻糖(食品級)，德州匯洋生物科技有限公司；焦性沒食子酸(鄰苯三酚)、濃鹽酸、H2O2、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、乙醇均為分析純AR，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰酶-EDTA、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2 (MTT)均為生物試劑BR，上?；瘜W(xué)試劑公司；小牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；DCFH-DA熒光探針，南京建成生物工程研究所；去離子水，實驗室自制。

752 S型紫外可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；Multiskan GO型酶標(biāo)儀、Heracell 150i型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Lumina熒光分光光度計，Thermo Scientific公司；HH-3A型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；KQ 5200型超聲波清洗器，南京實驗儀器廠；BSA 224S型分析天平，上海天平儀器廠；SW-CJ-1B標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；紫外光輻照計，北京師范大學(xué)光電儀器廠 。

1.2 抗氧化活性測定

1.2.1 清除DPPH自由基(DPPH·)的能力測定

DPPH·是一種比較穩(wěn)定的自由基，被廣泛用于測定多糖樣品的抗氧化能力[14-15]。配制DPPH的乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入20、10、5、4、2、1和0.5 mg/mL的αGG及海藻糖溶液，搖勻，室溫靜置20 min，在517 nm處使用酶標(biāo)儀測定吸光值A(chǔ)1。不同濃度的αGG及海藻糖溶液與體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液混合測得吸光值A(chǔ)2，蒸餾水與150 μL DPPH溶液混合后的吸光度A0為對照。平行測定3次，取平均值，計算見式(1)。

(1)

式中：A0為50 μL蒸餾水+150 μL DPPH溶液的吸光值；A1為50 μL樣品溶液+150 μL DPPH溶液的吸光值；A2為50 μL樣品溶液+150 μL 95%乙醇溶液的吸光值。

1.2.2 清除羥基自由基(·OH)的能力測定

選用Fenton反應(yīng)法測定·OH清除率[16]。配制9 mmol/L的水楊酸-乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，先加入9 mmol/L FeSO4，再分別加入20、10、5、4、2、1和0.5 mg/mL的αGG及海藻糖水溶液，最后加入8.8 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)，搖勻，置于37 ℃中水浴反應(yīng)30 min，以去離子水為空白對照，在510 nm下測定各待測樣品的吸光值?？紤]到樣品本身的吸光值，以9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液100 μL、不同濃度的抗壞血酸樣品溶液100 μL和100 μL去離子水作為樣品調(diào)零。平行測定3次，取平均值，計算見式(2)。

(2)

式中：A0′為空白對照組的吸光值；Ax′為樣品組的吸光值；Ax0′為未加顯色劑樣品組的吸光值。

(3)

式中：A0″為空白對照組的吸光值；Ax″為樣品的吸光值。

1.3 αGG對L929細(xì)胞活力影響的檢測方法

采用MTT(methylthiazole-trazolium)法[19]檢測αGG對小鼠成纖維細(xì)胞的活力影響。一定濃度條件下，細(xì)胞可攝取MTT，并被線粒體脫氫酶(主要是琥珀酸脫氫酶)氧化形成藍(lán)紫色的難溶性顆粒，而死細(xì)胞無此功能；該顆粒在培養(yǎng)液中不溶解，用二甲基亞砜(DMSO)溶解顆粒，然后用酶標(biāo)儀測定吸光值，其吸光值與細(xì)胞活力成正比[20]。

L929以2×104每孔的密度種于96孔板中，分為4組，每組5個孔，實驗分組情況：對照組(CK)、αGG及海藻糖質(zhì)量濃度分別為20、10和5 mg/mL。培養(yǎng)24 h后，每孔加入50 μL MTT溶液，在37 ℃、5% CO2的生化培養(yǎng)箱孵育4 h，將MTT還原為甲月臜。取出后，吸取上清液，每孔加入200 μL DMSO溶解甲月臜，振蕩10 min。在490 nm處檢測吸光值，細(xì)胞存活率以RT/C表示,具體計算見式(4)。

(4)

式中：T為處理過的細(xì)胞吸光值，C為正常對照細(xì)胞的吸光值。

1.4 紫外保護(hù)模型和修復(fù)模型的建立

紫外保護(hù)模型的建立：將L929細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，分成8組(標(biāo)記為A1、A2、B1、B2、B3、C1、C2和C3)，每組5個平行。其中，A組不加樣品，B組加不同濃度αGG樣品，C組加不同質(zhì)量濃度海藻糖樣品(20、10和5 g/L)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，經(jīng)PBS溶液清洗后，加入等體積PBS溶液，細(xì)胞培養(yǎng)板在距離紫外燈10 cm處輻照30 min(輻照劑量5 J/cm2)，其中A1組用錫箔紙覆蓋以阻隔紫外輻射。紫外輻照結(jié)束后，棄去PBS，加入37 ℃預(yù)熱過的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。取出孔板觀察細(xì)胞形態(tài)。棄上清液，通過MTT法測定各孔的吸光度。然后使用吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色法(AO/EB)對細(xì)胞進(jìn)行染色，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察[21]。

紫外修復(fù)模型的建立：將L929細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，分成8組(標(biāo)記為A1、A2、B1、B2、B3、C1、C2、C3)，每組均加入DMEM完全培養(yǎng)基，5個平行，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄上清液，經(jīng)PBS溶液清洗后，加入等體積PBS溶液，進(jìn)行紫外輻照(A1組用錫箔紙覆蓋)，細(xì)胞培養(yǎng)板在距離紫外燈10 cm處輻照30 min(輻照劑量5 J/cm2)。輻照結(jié)束后棄去PBS，清洗后在每孔中加入培養(yǎng)基，其中，A組不加樣品，B組加不同濃度αGG樣品，C組加不同質(zhì)量濃度海藻糖樣品(20、10、5 g/L)，再培養(yǎng)24 h。取出孔板觀察細(xì)胞形態(tài)。棄上清液，通過MTT法測定各孔的吸光度。然后使用吖啶橙/溴化乙錠雙熒光染色法(AO/EB)對細(xì)胞進(jìn)行染色，并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化活性測定

2.1.1 清除DPPH·的能力結(jié)果

抗氧化劑通過轉(zhuǎn)移傳遞電子或氫原子給DPPH·來中和其自由基，對DPPH·的清除效果可以反映抗氧化劑的供氫能力。本實驗中，DPPH·用來考察αGG樣品清除質(zhì)子的能力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：αGG、海藻糖對DPPH·均具有一定的清除能力，在試驗質(zhì)量濃度內(nèi)，DPPH·清除率呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。αGG質(zhì)量濃度越高，DPPH·清除率越強(qiáng)；相同質(zhì)量濃度時，αGG、海藻糖對于DPPH·的清除率由大到小為αGG、海藻糖；當(dāng)其質(zhì)量濃度均為20 mg/mL時，αGG以及海藻糖對于DPPH·清除率分別為29.8%和9.2%。因此，αGG對DPPH·的清除能力遠(yuǎn)優(yōu)于海藻糖。

圖1 αGG和海藻糖清除DPPH·的能力Fig.1 DPPH· scavenging properties of αGG and trehalose

2.1.2 清除·OH的能力

羥基自由基被認(rèn)為是最有害的自由基，是造成氧化傷害的主要原因。本實驗中，利用水楊酸捕捉H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH的方法，檢測αGG對·OH的清除作用，以抗壞血酸作為清除·OH的標(biāo)準(zhǔn)品對照，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：αGG、海藻糖對·OH均具有一定的清除能力，在試驗質(zhì)量濃度內(nèi)，·OH清除率呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，αGG質(zhì)量濃度越高，·OH清除率越強(qiáng)。當(dāng)其質(zhì)量濃度均為20 mg/mL時，αGG以及海藻糖對于·OH清除率分別為80.0%和87.2%。因此，αGG對·OH的清除能力稍弱于海藻糖。

圖2 αGG和海藻糖清除·OH的能力Fig.2 ·OH scavenging properties of αGG and trehalose

圖3 αGG和海藻糖清除的能力 scavenging properties of αGG and trehalose

2.2 αGG對L929細(xì)胞活力的影響

**表示P<0.01 vs CK圖4 αGG和海藻糖對L929細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of αGG and trehalose on L929 cell viability

在L929細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入不同質(zhì)量濃度的αGG或海藻糖溶液，考察培養(yǎng)24 h后αGG和海藻糖對細(xì)胞生長的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：當(dāng)培養(yǎng)基中加入海藻糖時，隨著海藻糖濃度的增加，吸光度未發(fā)生顯著性下降，說明在0～10 g/L范圍內(nèi)，海藻糖對細(xì)胞無抑制作用，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到20 g/L時，細(xì)胞存活率略有下降，但L929細(xì)胞增殖也未受到抑制。同樣，培養(yǎng)基中加入αGG對細(xì)胞正常生長沒有影響，且細(xì)胞數(shù)量隨αGG質(zhì)量濃度的增加而增多。當(dāng)αGG達(dá)到10 g/L時，細(xì)胞存活率已經(jīng)較對照組增加到128.7%，當(dāng)αGG增加到20 g/L時，細(xì)胞存活率從對照組的100%增加到129%。結(jié)果表明，一定濃度的海藻糖和αGG對L929細(xì)胞的生長都無抑制作用，且大于10 g/L的αGG極大地促進(jìn)L929細(xì)胞的生長；而濃度逐步提高時，海藻糖對L929細(xì)胞增殖未有抑制作用，且促生作用有限。

2.3 αGG對受紫外損傷細(xì)胞的保護(hù)及修復(fù)能力

紫外照射會嚴(yán)重?fù)p傷真皮層中的成纖維細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞的增殖能力對皮膚的正常修復(fù)起著決定性作用。筆者分別測定了不同質(zhì)量濃度的αGG和海藻糖對紫外照射后L929細(xì)胞的保護(hù)與修復(fù)作用，其中保護(hù)作用是指先加保護(hù)劑再進(jìn)行輻照，修復(fù)作用是指先進(jìn)行輻照再添加保護(hù)劑，并分別對細(xì)胞存活率以及細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行研究。

圖5 αGG和海藻糖對受紫外損傷細(xì)胞的保護(hù)作用Fig.5 Protection effects of αGG and trehalose on UV damaged cells

利用建立的L929細(xì)胞紫外輻射模型，考察αGG對紫外輻射損傷細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果如圖5所示。由圖5(a)可知：當(dāng)αGG達(dá)到20 g/L時，經(jīng)過輻照的L929細(xì)胞存活率達(dá)到90.5%；而培養(yǎng)基未添加αGG的L929細(xì)胞存活率僅為56.7%，添加海藻糖的L929細(xì)胞存活率也僅為52.5%。因此，αGG具有保護(hù)紫外輻照后L929細(xì)胞活性的作用。由圖5(b)可以看出：未經(jīng)紫外輻照的L929細(xì)胞，經(jīng)染色后呈現(xiàn)綠色熒光，當(dāng)L929細(xì)胞經(jīng)紫外輻照30 min后，經(jīng)染色后出現(xiàn)紅色熒光；然而，當(dāng)在L929細(xì)胞中添加5～20 g/L的αGG，再經(jīng)30 min的紫外輻照后，相比未添加αGG僅輻照組，其紅色熒光明顯減少，海藻糖組紅色熒光沒有顯著變化，這與MTT分析結(jié)果相符合。說明αGG具有保護(hù)紫外輻射后的細(xì)胞活性作用。

利用建立的L929細(xì)胞紫外修復(fù)模型，考察αGG的紫外修復(fù)作用，結(jié)果如圖6所示。由圖6(a)可知：當(dāng)αGG達(dá)到20 g/L時，經(jīng)過輻照的L929細(xì)胞存活率達(dá)到87.6%，而培養(yǎng)基未添加αGG的L929細(xì)胞存活率僅為56.7%，添加海藻糖的L929細(xì)胞存活率也僅為48.6%。因此，αGG具有修復(fù)紫外輻照后L929的細(xì)胞活性的作用。由圖6(b)可知：當(dāng)在L929細(xì)胞經(jīng)過紫外輻照之后添加含有5～20 g/L的αGG培養(yǎng)基，相比未添加αGG僅輻照組，其紅色熒光明顯減少，海藻糖組紅色熒光沒有顯著變化，說明αGG具有修復(fù)紫外輻射后的細(xì)胞活性作用。

圖6 αGG和海藻糖對受紫外損傷細(xì)胞的修復(fù)作用Fig.6 Repair effects of αGG and trehalose on UV damaged cells

3 結(jié)論

本文中，筆者通過酶法制得的αGG開展了抗氧化性能以及抗紫外損傷細(xì)胞修復(fù)、保護(hù)作用工作，得到了如下結(jié)論：

②αGG對L929細(xì)胞生長存在一定程度的增殖作用。當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg/mL時，細(xì)胞存活率相對提高29.0%。

③αGG對L929細(xì)胞抗紫外損傷具有一定程度的修復(fù)及保護(hù)作用。對于預(yù)添加αGG的細(xì)胞，存活率較未添加的細(xì)胞，從56.7%提高至90.5%，提高了59.6%，說明αGG對于L929細(xì)胞抗紫外損傷存在保護(hù)作用。對于后添加αGG的細(xì)胞，存活率較未添加的細(xì)胞，從56.7%提高至87.6%，提高了54.5%，說明αGG對L929細(xì)胞抗紫外損傷存在修復(fù)作用。

目前，αGG作為天然的保濕劑，在食品、藥品以及化妝品中尚未得到有效開發(fā)，本文的研究工作有望為αGG在保濕、抗衰老化妝品以及藥品添加劑等方面提供相關(guān)依據(jù)。