鄭華亮，賈小峰，馬魯南，劉 忠，張貴民

(山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司 山東省蛋白類藥物工程實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 273400)

2017年國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的第8版糖尿病概覽數(shù)據(jù)顯示，我國糖尿病(20～79歲)患病人數(shù)達(dá)到了1.14億[1]，糖尿病已成為繼心血管疾病和癌癥之后，嚴(yán)重危害我國人民健康的三大疾病之一[2]。人胰島素分短效、中效和長效三類，目前市場上應(yīng)用于臨床的長效胰島素有甘精胰島素、地特胰島素等。地特胰島素由丹麥諾和諾德公司研制，于2004年在歐洲上市。地特胰島素是第一個(gè)采用化學(xué)修飾方法獲得的胰島素類似物，即將天然人胰島素分子B鏈上的第30位蘇氨酸去掉，通過?；磻?yīng)在第29位賴氨酸上結(jié)合一個(gè)C14游離脂肪酸[3]，C14游離脂肪酸可以與血液中的白蛋白結(jié)合，形成蛋白結(jié)合體，從而延長作用時(shí)間[4-5]。目前，國際市場僅有原研藥諾和諾德上市，2019年銷售收入15.4億美元，國內(nèi)地特胰島素只有幾家藥企處于申報(bào)階段，且普遍存在表達(dá)量低、表達(dá)的胰島素前體容易形成包涵體等問題。

近年來，以低等真核生物酵母作為表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白越來越被廣泛研究和應(yīng)用。與大腸桿菌相比，酵母表達(dá)的蛋白質(zhì)可以進(jìn)行翻譯后加工、修飾以及合理的空間折疊，能有效克服大腸桿菌系統(tǒng)缺乏蛋白相關(guān)修飾的不足[6]。1983年，Wegner[7]為克服釀酒酵母的局限，開發(fā)了以畢赤酵母甲醇營養(yǎng)型酵母為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母由于醇氧化酶(AoXl)基因的強(qiáng)啟動(dòng)子，特別適合于外源基因的調(diào)控表達(dá)[8]，采用這個(gè)系統(tǒng)成功表達(dá)了200種以上蛋白，包括病毒、細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物和某些人源蛋白[9]。在甲醇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，受不同蛋白氨基酸組成以及空間結(jié)構(gòu)差異等因素影響，其最優(yōu)表達(dá)條件不同，在發(fā)酵過程中，pH、溫度、溶氧、甲醇誘導(dǎo)量和誘導(dǎo)前菌體濃度都可能對蛋白表達(dá)有很大影響[10-13]。

因此，本文中，筆者嘗試采用酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)胰島素前體，以帶有編碼地特胰島素前體DesB30基因的甲醇營養(yǎng)型重組畢赤酵母為實(shí)驗(yàn)菌株，使用5 L玻璃發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，考察pH、溫度、誘導(dǎo)前菌體濃度和甲醇流加速度對地特胰島素前體DesB30蛋白表達(dá)的影響，擬通過優(yōu)化發(fā)酵條件得到高表達(dá)可溶性的目的蛋白。

1 材料與方法

1.1 菌株

畢氏酵母(Pichiapastoris)GS115菌株，載體為pPIC9K(分泌性表達(dá)載體)，信號(hào)肽來自釀酒酵母的α-雜交因子。重組人胰島素源類似物HMPIDesB30基因根據(jù)酵母密碼子的偏好性人工合成。按照Multi-copyPichiaexpression Ki(Version B)經(jīng)SalⅠ酶切，用電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒HMPIDesB30/pPIC9K轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，隨后通過組氨酸缺陷培養(yǎng)基以及G418抗性培養(yǎng)基篩選具有外源基因高拷貝數(shù)的菌株，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作參考畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)手冊。構(gòu)建的菌株保存于山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

YPD種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母粉10.0。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基(BSM)(1 L)：85%H3PO426.7 mL，CaSO40.93 g，K2SO418.2 g，MgSO4·7H2O 14.9 g，KOH 4.13 g，甘油40 g，PTM1微量元素溶液12 mL[14]。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%甘油，每1 000 mL含有12 mL PTM1微量元素溶液。

PTM1(1 L)：CuSO4·5H2O 6.0 g，KI 0.08 g，MnSO4·H2O 3.0 g，Na2MoO40.2 g，H3BO30.02 g，CoCl20.5 g，ZnSO420.0 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 65.0 g，VH(生物素)0.2 g，H2SO45.0 mL。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶種子培養(yǎng)

從平板上挑取單菌落接種至100 mL YPD培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜至OD600為5.0左右。

1.3.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

將搖瓶種子液按照體積分?jǐn)?shù)4%接種量接入到裝有2 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基的五聯(lián)裝5 L玻璃發(fā)酵罐中，每升培養(yǎng)基添加4.35 mL PTM1微量元素溶液，用氨水調(diào)初始pH至5.0。當(dāng)甘油耗盡，溶氧快速回升到80%以上后，開始補(bǔ)加質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%甘油，流加速度為18.15 mL/(h·L)(以初始發(fā)酵體積計(jì))。甘油補(bǔ)料結(jié)束后，待溶氧快速回升后調(diào)到合適的pH和誘導(dǎo)溫度。隨后補(bǔ)加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。開始保持低速流加甲醇，之后緩慢提高甲醇補(bǔ)加速度，根據(jù)Invitrogen公司提供的方法，補(bǔ)加速度最終提升至10.9 mL/(h·L)，并保持至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵時(shí)間為128 h左右。通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、罐壓、空氣流量使溶氧大于10%。甲醇誘導(dǎo)期間取樣檢測，測定菌體濃度(以菌體濕質(zhì)量表示)，離心收集上清液并進(jìn)行蛋白濃度測定。在此基礎(chǔ)上分別對誘導(dǎo)pH、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度和甲醇補(bǔ)速進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

1.3.3 細(xì)胞濕質(zhì)量

取40 mL發(fā)酵液,12 000 r/min 離心10 min,去上清液，稱菌體質(zhì)量。

1.3.4 目的蛋白DesB30濃度測定

發(fā)酵液12 000 r/min離心，上清液用鹽酸調(diào)pH至4.0，經(jīng)0.45 μm膜過濾后進(jìn)行HPLC(島津公司)分析，色譜柱為C18。流動(dòng)相A(5%乙睛，0.1%三氟乙酸)，流動(dòng)相B(95%乙睛，0.1%三氟乙酸)。洗脫條件：先用流動(dòng)相A平衡柱子，洗脫條件為30 min流動(dòng)相B從0～100%，流速1 mL/min，柱溫40 ℃[15]。蛋白含量計(jì)算見式(1)。

發(fā)酵液蛋白濃度=發(fā)酵液上清液峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品峰面積×標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對DesB30表達(dá)的影響

由于畢赤酵母可耐受較寬的pH(pH 3.0～7.0)，因此可以通過優(yōu)化 pH 條件來提高目的蛋白的表達(dá)量。為了確定DesB30表達(dá)最適的pH條件，在誘導(dǎo)溫度為25 ℃、誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度280 g/L培養(yǎng)條件下，選擇pH 5.5、6.0、6.5和7.0不同梯度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示。由圖1(a)發(fā)酵結(jié)果可知：在不同pH條件下，誘導(dǎo)前期和誘導(dǎo)后期的生物量相差不大，生長趨勢幾乎無差別，說明pH對菌體的生長影響較小，發(fā)酵后期濕菌體質(zhì)量濃度均能達(dá)到500 g/L左右。

圖1 不同pH對菌體濕質(zhì)量和DesB30表達(dá)的影響Fig.1 Effects of pH on wet weight of bacteria and DesB30

在不同pH誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)24 h后，經(jīng)HPLC檢測，DesB30已有少量表達(dá)。在pH 6.0和pH 6.5條件下，DesB30表達(dá)相差不大，具有較高的表達(dá)量。與pH 6.0和pH 6.5條件下的表達(dá)量相比，pH 5.5和pH 7.0條件下的表達(dá)量在誘導(dǎo)24 h后至發(fā)酵結(jié)束這一階段明顯降低(圖1(b))。中性條件pH 7.0并不是蛋白表達(dá)的最適條件，因此，DesB30在中性條件下表達(dá)量很低，DesB30的等電點(diǎn)pI為5.5，在pH 5.5的條件下，DesB30的表達(dá)量偏低，可能是由于DesB30在等電點(diǎn)附近時(shí)目的蛋白溶解度較低，一部分蛋白分泌到上清液后沉淀出來造成單位偏低。綜上，DesB30最適的表達(dá)pH為6.0～6.5，偏中性或者偏酸性都不利于目的蛋白的表達(dá)。

2.2 誘導(dǎo)溫度對DesB30表達(dá)的影響

通過pH單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DesB30最適表達(dá)條件為pH 6.0～6.5。選取誘導(dǎo)表達(dá)pH為6.0、誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度280 g/L條件下，分別設(shè)置22、24、26、28和30 ℃這5個(gè)溫度梯度，以考察溫度對酵母工程菌的生長狀況和DesB30表達(dá)量的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：在22、24和26 ℃這3個(gè)溫度條件下，菌體生長狀態(tài)相似，生物量相差不大；在誘導(dǎo)48 h前，28和30 ℃這2個(gè)溫度條件下的菌體生長狀態(tài)與22、24和26 ℃這3個(gè)溫度條件下的生長狀態(tài)相似，但是在48 h以后，28和30 ℃這2個(gè)溫度條件下的菌體生長明顯變慢，并且96 h以后上清液變混濁，推測是在較高的溫度條件下菌體生長過快，在誘導(dǎo)過程中由于受到甲醇補(bǔ)速的限制，碳源供應(yīng)不足，影響了工程菌的生長，造成菌體部分自溶。

在誘導(dǎo)60 h前，在22、24、26和28 ℃條件下，DesB30表達(dá)量相差不大。誘導(dǎo)60 h后，22、24和26 ℃條件下的DesB30表達(dá)量明顯更高，到發(fā)酵后期，3個(gè)溫度條件下表達(dá)量相差不大。在22 ℃條件下，誘導(dǎo)表達(dá)104 h后表達(dá)量達(dá)到最大，而在24和26 ℃條件下，誘導(dǎo)表達(dá)128 h后表達(dá)量還有繼續(xù)增長的趨勢?？紤]到發(fā)酵過程中較低的溫度不易控制，選取26 ℃作為最合適的誘導(dǎo)溫度。

DesB30為分泌性表達(dá)，在28和30 ℃條件下誘導(dǎo)時(shí)，由于菌體部分自溶，蛋白酶釋放到上清液中，造成蛋白降解。因此，過高的溫度不利于蛋白的積累，而過低的溫度又影響了菌體的生長，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，甲醇容易積累，毒害菌體，后期培養(yǎng)條件不再適合菌體發(fā)酵，也不利于蛋白的積累，因此在實(shí)際發(fā)酵中盡量控制合適的溫度。

圖2 不同溫度對菌體濕質(zhì)量和DesB30 表達(dá)的影響Fig.2 Effects of temperature on wet weight of bacteria and DesB30

2.3 誘導(dǎo)前菌體濃度對DesB30表達(dá)的影響

為了考察誘導(dǎo)前菌體濃度對DesB30表達(dá)的影響，在誘導(dǎo)pH為6.0、誘導(dǎo)溫度26 ℃條件下，筆者選取了誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度分別為120、200和280 g/L 3個(gè)條件，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度為120 g/L時(shí)，誘導(dǎo)后菌體質(zhì)量濃度相比于誘導(dǎo)前200和280 g/L的菌體質(zhì)量濃度一直偏小。這表明誘導(dǎo)前菌體濃度太低的情況下，在相同甲醇補(bǔ)速條件下，甲醇濃度偏高，對菌體的毒害作用影響了菌體生長，進(jìn)而影響了DesB30的表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度200 g/L時(shí)，誘導(dǎo)之后生長比280 g/L時(shí)的更快，這可能是誘導(dǎo)前太高的菌體濃度，而甲醇補(bǔ)料不足導(dǎo)致碳源不足，使菌體生長受限，蛋白表達(dá)受影響；到后期菌體進(jìn)入平臺(tái)期，兩者菌體濃度相差不大。在誘導(dǎo)表達(dá)50 h前，3個(gè)誘導(dǎo)條件下，DesB30的表達(dá)區(qū)別不大；但在誘導(dǎo)表達(dá)60 h后，誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度200 g/L時(shí)的DesB30表達(dá)量比另外兩個(gè)條件下的表達(dá)量更大，這表明合適的誘導(dǎo)前菌體濃度對蛋白表達(dá)具有很大影響。由此確定200 g/L為最適的誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度。

圖3 不同初始菌體濃度對菌體濕質(zhì)量和DesB30 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of initial concentration on wet weight of bacteria and DesB30

2.4 甲醇流加速度對DesB30表達(dá)的影響

在誘導(dǎo)pH為6.0、誘導(dǎo)溫度26℃、誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度200 g/L條件下，繼續(xù)考察甲醇流加補(bǔ)速對DesB30表達(dá)的影響。根據(jù)Invitrogen公司提供的方法，選取甲醇終誘導(dǎo)補(bǔ)速分別為10.9、16.3和21.8 mL/(h·L)3個(gè)條件，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知:甲醇流加速度越大，菌體濃度越高，生長越旺盛，培養(yǎng)后期受各種條件影響，菌體生長進(jìn)入平臺(tái)期。在誘導(dǎo)前期，由于甲醇補(bǔ)速是逐漸增加的，在誘導(dǎo)40 h前，DesB30表達(dá)量相差不大；而在誘導(dǎo)40 h后，甲醇補(bǔ)速越大，DesB30表達(dá)量越大。由此可見，提高甲醇流加速率使發(fā)酵液中的甲醇濃度維持在較高水平，有利于DesB30的表達(dá)。但在誘導(dǎo)100 h后，較高的甲醇流加速率已造成細(xì)胞損傷，菌體濃度開始降低，逐漸進(jìn)入衰亡期。另外，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在較高的甲醇補(bǔ)速條件下，細(xì)胞代謝甲醇需要更多氧氣，受發(fā)酵罐條件限制，無法維持合適的溶氧水平，因此在誘導(dǎo)過程中合適的甲醇補(bǔ)速對細(xì)胞生長和蛋白表達(dá)至關(guān)重要。在誘導(dǎo)過程中，較高的甲醇補(bǔ)速致使菌體生長越旺盛，產(chǎn)熱嚴(yán)重，耗氧增加，對發(fā)酵罐的要求較高，而且甲醇終補(bǔ)速為16.3和21.8 mL/(h·L)條件下，誘導(dǎo)后期DesB30表達(dá)量相差不大。因此，綜合各種條件及考慮成本因素，確定甲醇終流加補(bǔ)速16.3 mL/(h·L)為最適條件。

圖4 不同甲醇補(bǔ)速下對菌體濕質(zhì)量和DesB30 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different methanol flow rate on wet weight of bacteria and DesB30

2.5 優(yōu)化條件下的發(fā)酵結(jié)果

在上述優(yōu)化的發(fā)酵條件下，使用5 L玻璃發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在30 ℃、pH 5.0培養(yǎng)條件下消耗基礎(chǔ)培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基中甘油消耗完畢后補(bǔ)料50%甘油，補(bǔ)料結(jié)束后調(diào)溫度至26 ℃，pH至6.5，0.5 h后甲醇誘導(dǎo)，15 h內(nèi)將甲醇補(bǔ)速提至16.3 mL/(h·L)，發(fā)酵過程中將溶氧控制在15%以上，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，下罐D(zhuǎn)esB30表達(dá)量能夠達(dá)到2.5 g/L左右。彭強(qiáng)強(qiáng)等[16]利用一株重組畢赤酵母，通過優(yōu)化的培養(yǎng)工藝，在5 L反應(yīng)器水平發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素前體，108 h后產(chǎn)量達(dá)到1.85 g/L。與彭強(qiáng)強(qiáng)等[16]研究結(jié)果相比，本研究的DesB30表達(dá)量高出35%左右，具有明顯的提升，說明本研究優(yōu)化的條件更能利于DesB30的表達(dá)。

3 結(jié)論

畢赤酵母具有能夠高效表達(dá)并有效分泌胞外蛋白、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，普遍用于重組蛋白商業(yè)生產(chǎn)。在本研究中，筆者通過畢赤酵母成功地表達(dá)了地特胰島素前體DesB30，并通過單因素實(shí)驗(yàn)，初步確定了DesB30蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件：誘導(dǎo)pH為6.0～6.5，誘導(dǎo)溫度26 ℃，誘導(dǎo)前菌體質(zhì)量濃度200 g/L，甲醇終補(bǔ)速16.3 mL/(h·L)。在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，5 L玻璃發(fā)酵罐中DesB30表達(dá)量能夠達(dá)到2.5 g/L左右。

單因素試驗(yàn)?zāi)艽_定DesB30各種發(fā)酵因素的最佳發(fā)酵條件，但各因素之間可能存在交互作用，后續(xù)還需通過中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)確定各因素之間最優(yōu)的比例。另外在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這種固定的甲醇誘導(dǎo)補(bǔ)料方式在發(fā)酵后期存在甲醇補(bǔ)料不足的問題，影響菌體正常生長，需要根據(jù)生長狀況和蛋白表達(dá)情況及時(shí)調(diào)整甲醇流加速率。本結(jié)果對下一步利用大型發(fā)酵罐進(jìn)行重組畢赤酵母發(fā)酵有借鑒作用，從而為DesB30大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。