秦亞飛，霍星光，李秋霞，徐玉生

（1.河南省周口骨科醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，河南 周口 466000；2.河南省周口市衛(wèi)生計(jì)生監(jiān)督局 公共衛(wèi)生監(jiān)督二科，河南 周口466000；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 骨科，河南 鄭州 450000）

急性重癥胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種常見(jiàn)急危重癥，并發(fā)癥多，病死率高[1]。 SAP發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡、微循環(huán)障礙等，發(fā)作時(shí)可激活胰蛋白酶，引發(fā)胰蛋白酶原分子活化，誘導(dǎo)分泌大量炎性細(xì)胞，引發(fā)胰腺組織炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡等，還可增加肺損傷、肝損傷等并發(fā)癥發(fā)生風(fēng) 險(xiǎn)[2-3]。因此，探尋一種有效治療方法，抑制SAP患者炎癥反應(yīng)，以減輕胰腺組織損傷，降低相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，改善預(yù)后，具有重要意義。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一種成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能、低免疫原性，可參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)，目前已在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等頑固性疾病治療中取得一定進(jìn)展[4-5]。近期研究[6]發(fā)現(xiàn)，MSC移植具有修復(fù)SAP胰腺組織損傷的潛能，但作用機(jī)制尚無(wú)深入研究。Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κBp65（nuclear factor-κBp65，NF-κBp65）通路是一種典型炎癥信號(hào)通路，激活后能對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，參與炎癥反應(yīng)過(guò)程[7]。相關(guān)報(bào)道[8]顯示，SAP發(fā)病過(guò)程中TLR4/NF-κBp65通路激活發(fā)揮重要作用。本研究就骨髓MSC對(duì)SAP大鼠炎癥抑制作用及其對(duì)TLR4/NF-κBp65通路影響進(jìn)行分析，以探討骨髓間MSC治療SAP的可能 機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD 健康雄性大鼠購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，許可證號(hào)：SYXK（京）2019-0050，7～8 周齡，體質(zhì)量280～320 g。所 有大鼠均在室溫22～24 ℃、相對(duì)濕度50%～60% 動(dòng)物飼養(yǎng)房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，標(biāo)準(zhǔn)飼料，無(wú)菌蒸餾水。本研究經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSC 分離、培養(yǎng)、鑒定及制備造模前1 周，隨機(jī)取5 只大鼠，2%戊巴比妥鈉50 mg/kg （0.25 mL/100 g）腹腔注射麻醉，斷頭處死，自股骨、脛骨收集原始骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。骨髓腔以DMEM沖洗，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)放置細(xì)胞，加含20% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于潮濕孵化器孵化，溫度37 ℃，濕度95%。觀察細(xì)胞融合超過(guò)80%時(shí)，經(jīng)多酶消化、傳代收獲，取第5 代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)，所用抗體為CD45、CD90，以同型對(duì)照抗體作為對(duì)照。移植前，將50 mg/L 含4，6- 聯(lián)脒-2- 苯基吲哚的無(wú)血清培養(yǎng)基加入骨髓MSC 培養(yǎng)瓶，避光，孵育，標(biāo)記細(xì)胞，共24 h。未結(jié)合的4，6- 聯(lián)脒-2- 苯基吲哚以磷酸緩沖鹽溶液沖洗，0.25% 胰蛋白酶消化，吹打。1000r/min 離心，離心半徑5 cm，共5 min，重復(fù)2 次。隨后以1500r/min 離心，離心半徑8 cm，共5 min，棄上清液。加入培養(yǎng)液，制備成細(xì)胞濃度1.0×106/mL 懸浮液。

1.2.2 骨髓MSC 活力檢測(cè)采用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞貼壁率及細(xì)胞克隆形成率評(píng)估細(xì)胞活力。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定：取第5 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，0.25%胰酶消化，接種在24 孔板，密度1×104/ 孔。每隔2 d，取3 個(gè)孔消化計(jì)數(shù)，各孔計(jì)3 次，取平均值，連續(xù)8 d，繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞貼壁率測(cè)定：取第5 代生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，0.25% 胰酶消化，經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)染色計(jì)算活細(xì)胞百分比，在3.5 cm 培養(yǎng)皿內(nèi)接種，濃度3.5×107/L，每隔2 h，隨機(jī)選擇 3 個(gè)培養(yǎng)皿計(jì)算細(xì)胞數(shù)，連測(cè)18 h，取平均值，繪制曲線。細(xì)胞克隆形成率測(cè)定：取第5 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，在6 孔板內(nèi)接種，密度100 個(gè)/孔， 培養(yǎng)16 d。經(jīng)錐蟲(chóng)藍(lán)染色法計(jì)數(shù)克隆細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率，即克隆細(xì)胞數(shù)/ 接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 模型制備與分組取40 只大鼠依據(jù)文獻(xiàn)[9]制定SAP 大鼠模型：術(shù)前禁食12 h，2% 戊巴比妥鈉50 mg/kg（0.25 mL/100g）腹腔注射麻醉，平臥位固定于手術(shù)臺(tái)。取上腹部正中切口，胰腺頭部顯露，探查十二指腸乳頭位置，于十二指腸乳頭旁，經(jīng)留置針刺破腸壁，探入胰膽管，插入深度 1.5 cm，肝總管以微血管鑷夾閉。將3.5%?；敲撗跄懰徕c0.1 mL/100 g 注入，注射速度0.1 mL/min，輸注后保持壓力10 min。以造模后肉眼下可見(jiàn)大鼠胰腺出現(xiàn)皂化斑形成、點(diǎn)狀出血、壞死等變化，為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。40 只大鼠造模成功36 只，成功率為90.0%。36 只大鼠隨機(jī)分為模型組、MSC 腹腔注射組（腹腔注射組）、MSC 尾靜脈注射組（尾靜脈注射組）、MSC 腹腔注射、尾靜脈注射（聯(lián)合注射組），每組各9 只。另取9 只大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組僅開(kāi)腹，翻動(dòng)數(shù)次胰腺，關(guān)腹，不做其他處理。

1.2.4 動(dòng)物干預(yù)造模成功后12 h 開(kāi)始給藥。腹腔注射組以1.0×106/mL 骨髓MSC 懸浮液進(jìn)行腹腔注射移植，劑量10 mL/kg。尾靜脈注射組以1.0×106/mL 骨髓MSC 懸浮液進(jìn)行尾靜脈注射移植，劑量10 mL/kg。聯(lián)合注射組同時(shí)以1.0×106/mL 骨髓MSC 懸浮液進(jìn)行腹腔注射、尾靜脈注射，劑量10 mL/kg。假手術(shù)組、模型組以等量生理鹽水腹腔注射，注射10 mL/kg。

1.2.5 取材及處理治療后24 h，大鼠以2% 戊巴比妥鈉50 mg/kg（0.25 mL/100g）腹腔注射麻醉，斷頭處死，打開(kāi)腹腔，以靜脈采血針穿刺下腔靜脈，抽取3 mL 血液，以備檢測(cè)血清AMS、LPS 水平；打開(kāi)腹腔，找到并分離胰腺組織，將胰腺組織分為5 份。其中4 份置于液氮保存，以備檢測(cè)炎癥指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)及TLR4、NF-κBp65 蛋白；另外 1 份置于4% 多聚甲醛固定，用于HE 染色。

1.2.6 胰腺組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)采用HE 染色法檢測(cè)。取4% 多聚甲醛保存胰腺組織，甩干殘余多聚甲醛溶液，梯度酒精脫水，二甲苯透明，包埋，切片，厚度3 μm。石蠟切片置于恒溫箱，加熱2 h。進(jìn)行HE 染色，95% 乙醇浸泡2 min，100% 乙醇浸泡10 min。二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。切片置于顯微鏡下觀察，各切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野（×200），分析胰腺組織病理形態(tài)學(xué)改變。根據(jù)Sehmidt 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理評(píng)分[10]。病理評(píng)分包括水腫、出血、壞死、炎癥4 項(xiàng)。水腫：無(wú)水腫，計(jì)0 分；小葉間隔擴(kuò)大擴(kuò)張，計(jì)1 分；小葉間隔擴(kuò)張，計(jì)2 分；腺泡隔膜彌漫擴(kuò)張，計(jì)3 分；細(xì)胞間隙彌漫擴(kuò)張，計(jì)4 分。出血：無(wú)出血，計(jì)0 分；1～2 處出血，計(jì)1 分；3～4 處出血，計(jì)2 分；5～6 處出血，計(jì)3 分；≥7 處出血，計(jì)4 分。壞死：無(wú)壞死，計(jì)0 分；1～4/HP 壞 死，計(jì)1 分；5～10/HP壞死，計(jì)2 分；11～16/HP 壞死，計(jì)3 分；≥17/HP 壞死，計(jì)4 分。炎癥：0～1/HP 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)0 分；2～10/HP 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)1 分；11～20/HP 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)2 分；21～30/HP 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)3 分；≥31/HP 炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，計(jì)4 分。由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科成員獨(dú)立進(jìn)行評(píng)分，取平均值。

1.2.7 血清AMS、LPS 水平檢測(cè)取大鼠下腔靜脈血，4 ℃，4000r/min 離心，離心半徑5 cm，共10 min，取上層血清。采用碘比色法檢測(cè)血清AMS 水平，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。采用甲基試鹵靈底物法檢測(cè)血清LPS 水平，嚴(yán)格按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作，根據(jù)產(chǎn)物紅色的甲基試鹵靈生成速率，對(duì)LPS 活性進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.8 IL-6、IL-1β、TNF-α水平檢測(cè)采 用ELISA 法檢測(cè)。取液氮保存胰腺組織，冰浴下制備10% 勻漿。4 ℃，10000r/min 離心，離心半徑 8 cm，共10 min，取上清液。嚴(yán)格按照IL-6、IL-1β、TNF-α 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作。觀察酶標(biāo)儀450 nm處吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)本吸光值獲得濃度。

第一、民間日常用銀的習(xí)慣。在白銀古道及其左近區(qū)域村落中，有日常使用銀器的習(xí)慣。富裕人家一般置有銀碗、銀筷等生活器物，據(jù)傳，銀子遇到毒會(huì)變黑，假若飯菜有毒會(huì)被測(cè)出，確保生命安全。此外亦有佩戴銀飾的習(xí)慣，如銀手鐲、銀項(xiàng)圈、銀腳鐲、銀鏈、銀耳環(huán)、銀耳墜、銀發(fā)髻、銀簪子，如果銀飾越戴越白，被認(rèn)為會(huì)戴銀，屬于富貴命，即“命好，會(huì)戴銀”之說(shuō)。相傳自明中后期以來(lái)，閩東地區(qū)，出嫁女子多佩戴銀發(fā)髻、銀簪子等，據(jù)傳：曾經(jīng)有女子洞房之夜行房時(shí)，新郎精流不止，女子想起母親曾經(jīng)的交代，用銀簪子刺向新郎腰間一穴位，終于化險(xiǎn)為夷。此外，閩東還有眾多畬族的銀飾。

1.2.9 SOD、MDA 水平檢測(cè)采用羥胺法檢測(cè)SOD 水平。取液氮保存胰腺組織，冰浴下制備10%勻漿。4 ℃，3500r/min 離心，離心半徑8 cm，共10 min，取上清液。嚴(yán)格按照SOD 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作，每組3 孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA 水平。胰腺組織加入10 mL 離心管，相同體積磷酸緩沖鹽溶液加入調(diào)零管。各管分別加入0.6% TBA 溶液2 mL，混勻，沸水浴15 min。完成沸水浴后快速流水冷卻，取離心管液體，4 ℃，10000r/min 離心，離心半徑5 cm，共10 min，取上清液，加入酶標(biāo)板。觀察各組酶標(biāo)儀450 nm、532 nm、600 nm 波長(zhǎng)處吸光度值，以6.45（D532nm-D600nm）-0.56D450nm計(jì)算MDA 水平。

1.2.10 胰腺組 織TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)采用RT-PCR 法檢測(cè)。取液氮保存胰腺組織，經(jīng)Trizol 法提取總RNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的總RNA 質(zhì)量、濃度，將總RNA 進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)施RTPCR 反應(yīng)。采用GeneBank 基因庫(kù)內(nèi)大鼠TLR4、MyD88、NF-κBp65 基因序列。引物設(shè)計(jì)：TLR4正向：5'-GAG GACTGG GTG AGA AAG GA-3'；反向：5'-GAA ACT AGG GAT GGT GAG GA-3'。MyD88 正 向：5'-ATC GCT GTT CTT GAA CCCTCG-3'；反向：5'-CTC ACG GTCTAA CAG GCC AG-3'。NF-κBp65 正 向：5'-ATG TTC CAD GTA TGA CTA TCA GG-3'； 反 向：5'-GAA GAG ACC AGT AAT CAC GAC A-3'。β-actin 正向：5'-TAC GAT TCT CCC ATC AACT-3'；反向：5'-GTCTGG TAA TCT CGC ACT C-3'。反應(yīng)條件：95 ℃變性，3 min；95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，10 min，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：12.5 μL Power Taq PCR Master Mix，1 μL 上游引物、下游引物，1.5 μL cDNA。瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析電泳條帶，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度（2-△△CT）。

1.2.11 胰腺組 織TLR4、MyD88、NF-κBp65 蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)采用Western blot 法檢測(cè)。取液氮保存胰腺組織，置于玻璃勻漿容器，加入 1 mL PIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑，冰上勻漿，超聲粉碎機(jī)粉碎。4 ℃，12000r/min 離心，離心半徑5 cm，共15 min，取上清液。以等體積2× 上樣緩沖液加入，煮沸，共10 min，蛋白變性，收獲組織總蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)。加入5% 脫脂奶粉，室溫下，搖床封閉2 h。加入TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NF-κBp65 一抗（1:500），4 ℃，孵育過(guò)夜；加入山羊抗兔二抗IgG（1:5000），室溫下孵育2 h。孵育后，室溫下以TBST 搖床洗膜10 min，共3 次。曝光，顯影，定影，置于凝膠成像儀，觀察TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NF-κBp65 蛋白表達(dá)。以ImageJ 圖像分析軟件，對(duì)各目標(biāo)條帶的灰度值進(jìn)行分析。以β-actin 為內(nèi)參，目的蛋白表達(dá)水平根據(jù)目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，重復(fù)計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓MSC 鑒定

顯微鏡下顯示骨髓MSC呈梭形、漩渦樣生長(zhǎng)（圖1）；流式細(xì)胞儀顯示細(xì)胞低表達(dá)CD45，表達(dá)量為1.25%；高表達(dá)CD90，表達(dá)率為99.89% （圖2）。

2.2 骨髓MSC 活力檢測(cè)

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示，第5 代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形，1 d內(nèi)為潛伏期，2～5 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，自第6 d細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，第8 d進(jìn)入停止期。細(xì)胞貼壁率結(jié)果顯示，第5代活細(xì)胞比例為97%，接種14 h貼壁率達(dá)高值，此后呈穩(wěn)定狀態(tài)，貼壁率（96.12±0.85）%。細(xì)胞克隆形成率結(jié)果顯示，第5代細(xì)胞接種6 d鏡下出現(xiàn)細(xì)胞集落。這些結(jié)果提示第5代細(xì)胞活力良好（圖3）。

圖1 第5 代骨髓MSC 形態(tài)（×100）Figure 1 Morphology of bone marrow MSCs at 5th passage (×100)

圖2 流式細(xì)胞分析 A：低表達(dá)CD45（1.25%）；B：高表達(dá)CD90（99.89%）Figure 2 Flow cytometry analysis A: Low CD45 expression (1.25%); B: High CD90 expression (99.89%)

圖3 骨髓MSC 活力檢測(cè) A：第5 代骨髓MSC 生長(zhǎng)曲線；B：第5 代骨髓MSC 的貼壁率Figure 3 Determination of the viability of the bone marrow MSCs A: Growth curve bone marrow MSCs at the 5th passage; B: Adherence rate of the bone marrow MSCs at the 5th passage

2.3 胰腺組織病理形態(tài)學(xué)及病理評(píng)分

假手術(shù)組胰腺組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，間質(zhì)鮮見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組胰腺組織腺體結(jié)構(gòu)紊亂，存在大量壞死細(xì)胞，腺泡出現(xiàn)水腫、破裂，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體間隙及血管周圍存在紅細(xì)胞滲出。與模型組比較，腹腔注射組、尾靜脈注射組、聯(lián)合注射組胰腺組織病理變化不同程度減輕，腺體結(jié)構(gòu)輕微紊亂，腺泡輕微水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，其中聯(lián)合注射組改善更為明顯（圖4）。各造模組水腫、出血、壞死、炎癥評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。模型組、腹腔注射組、尾靜脈注射組、聯(lián)合注射組的水腫、出血、壞死、炎癥評(píng)分依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表1）。

2.4 血清AMS、LPS 水平

與假手術(shù)組比較，各造模組AMS、LPS水平比均明顯升高（均P ＜0.05），但兩項(xiàng)指標(biāo)在模型組、腹腔注射組、尾靜脈注射組、聯(lián)合注射組的升高程度依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

2.5 IL-6、IL-1β、TNF-α 水平

與假手術(shù)組比較，各造模組IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明顯升高（均P＜0.05），但各項(xiàng)指標(biāo)在模型組、腹腔注射組、尾靜脈注射組、聯(lián)合注射組的升高程度依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表3）。

2.6 SOD、MDA 水平

與假手術(shù)組比較，各造模組SOD水平明顯降低、MDA水平明顯升高（均P＜0.05），且兩項(xiàng)指標(biāo)的變化程度在模型組、腹腔注射組、尾靜脈注射組、聯(lián)合注射組依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（表4）。

圖4 各組大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)改變（HE×200） A ：假手術(shù)組；B ：模型組；C ：腹腔注射組；D ：尾靜脈注射組；E ：聯(lián)合注射組Figure 4 Comparison of pathological changes of the pancreatiCTissue in each group (HE×200) A: Sham operation group; B: Model group; C: Intraperitoneal injection group; D: Tail vein injection group; E: Combined injection group

表1 各組大鼠胰腺病理評(píng)分比較（±s，n=9）Table 1 Comparison of pathological scores of pancreas among groups (±s, n=9)

表1 各組大鼠胰腺病理評(píng)分比較（±s，n=9）Table 1 Comparison of pathological scores of pancreas among groups (±s, n=9)

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與腹腔注射組比較，P＜0.05；4）與尾靜脈注射組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.model group; 3) P＜0.05 vs.intraperitoneal injection group; 4) P＜0.05 vs.tail vein injection group

組別 水腫 出血 壞死 炎癥假手術(shù)組 0.20±0.12 0.20±0.11 0.20±0.11 0.20±0.13模型組 3.60±0.151) 3.20±0.131) 1.80±0.121) 2.40±0.151)腹腔注射組 1.80±0.151),2) 2.20±0.141),2) 1.60±0.131),2) 1.80±0.131),2)尾靜脈注射組 1.60±0.151),2),3) 1.80±0.121),2),3) 1.20±0.121),2),3) 1.20±0.131),2),3)聯(lián)合注射組 1.20±0.181),2),3),4) 1.20±0.121),2),3),4) 0.80±0.111),2),3),4) 0.80±0.141),2),3),4)F 586.723 748.207 418.726 528.307 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與腹腔注射組比較，P＜0.05；4）與尾靜脈注射組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.model group; 3) P＜0.05 vs.intraperitoneal injection group; 4) P＜0.05 vs.tail vein injection group

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與腹腔注射組比較，P＜0.05；4）與尾靜脈注射組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.model group; 3) P＜0.05 vs.intraperitoneal injection group; 4) P＜0.05 vs.tail vein injection group

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與腹腔注射組比較，P＜0.05；4）與尾靜脈注射組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.model group; 3) P＜0.05 vs.intraperitoneal injection group; 4) P＜0.05 vs.tail vein injection group

2.7 TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA 相對(duì)表達(dá)量

與假手術(shù)組比較，各造模組TLR4、MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05），且兩項(xiàng)指標(biāo)的變化程度在模型組、腹腔注射組、尾靜脈注射組、聯(lián)合注射組依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；各組NF-κBp65表達(dá)水平組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表5）。

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與腹腔注射組比較，P＜0.05；4）與尾靜脈注射組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.model group; 3) P＜0.05 vs.intraperitoneal injection group; 4) P＜0.05 vs.tail vein injection group

2.8 TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NFκBp65 蛋白相對(duì)表達(dá)量

與假手術(shù)組比較，各造模組TLR4、MyD88蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-NF-κBp 65/NF-κBp65 均明顯升高（均P ＜0.05）。且各項(xiàng)指標(biāo)的變化程度在模型組、腹腔注射組、尾靜脈注射組、聯(lián)合注射組依次降低，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖5）（表6）。

圖5 Western blot 檢測(cè)胰腺組織TLR4、p-NF-κBp65、NF-κBp65 蛋白表達(dá)Figure 5 Protein expressions of TLR4, p-NF-κBp65 and NFκBp65 in pancreatiCTissue determined by Western blot

表6 各組TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NF-κBp65 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 6 Comparison of relative protein expressions of TLR4, MyD88 , p-NF-κBp65 and NF-κBp65 among groups (±s)

表6 各組TLR4、MyD88、p-NF-κBp65、NF-κBp65 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）Table 6 Comparison of relative protein expressions of TLR4, MyD88 , p-NF-κBp65 and NF-κBp65 among groups (±s)

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05；3）與腹腔注射組比較，P＜0.05；4）與尾靜脈注射組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.sham operation group; 2) P＜0.05 vs.model group; 3) P＜0.05 vs.intraperitoneal injection group; 4) P＜0.05 vs.tail vein injection group

組別 TLR4 MyD88 p-NF-κBp65/NF-κBp65假手術(shù)組 0.21±0.05 0.17±0.02 0.76±0.06模型組 0.65±0.081) 0.42±0.041) 1.35±0.081)腹腔注射組 0.41±0.051),2) 0.35±0.021),2) 1.15±0.091),2)尾靜脈注射組 0.38±0.041),2),3) 0.28±0.041),2),3) 0.96±0.071),2),3)聯(lián)合注射組 0.31±0.041),2),3),4) 0.25±0.041),2),3),4) 0.88±0.081),2),3),4)F 85.430 73.366 82.883 P ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討 論

SAP起病急，病情重，可引發(fā)胰腺出血、壞死，且易繼發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙，病死率高[11-12]。當(dāng)前，圍繞SAP機(jī)制及治療的眾多研究[13-15]表明，中性粒細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在該病病理、生理變化中有一定作用，如TNF-α。TNF-α屬于炎癥始動(dòng)因子，可介導(dǎo)IL-6、IL-1β、IL-8等多種炎癥細(xì)胞因子釋放，且能激活氧自由基、一氧化氮生成，促進(jìn)白細(xì)胞趨化、黏附，造成胰腺組織受損[16]。故需在SAP治療中，探尋有效手段抑制炎癥反應(yīng)，減輕胰腺組織損傷，改善預(yù)后。骨髓MSC是一種成體干細(xì)胞，分化潛能較高，可經(jīng)分泌TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子，參與機(jī)體炎癥及免疫調(diào)節(jié)[17-18]。相關(guān)報(bào)道[19]顯示，骨髓MSC可隨機(jī)體血液循環(huán)到達(dá)受損部位，經(jīng)誘導(dǎo)分化成相應(yīng)成體細(xì)胞，促進(jìn)組織損傷修復(fù)，控制炎癥反應(yīng)。還有報(bào)道[20]顯示，隨著機(jī)體骨髓MSC的細(xì)胞量增多，干細(xì)胞轉(zhuǎn)化率逐漸升高，可促使炎性癥狀減輕，炎性介質(zhì)減少，但就骨髓MSC對(duì)SAP炎癥抑制調(diào)控機(jī)制尚無(wú)明確報(bào)道。而本研究就該問(wèn)題進(jìn)行分析，著重探討骨髓MSC對(duì)SAP炎癥抑制作用及機(jī)制，對(duì)SAP臨床診斷、治療有一定指導(dǎo)意義。

SAP治療最直接的干細(xì)胞應(yīng)為胰腺干細(xì)胞，但其數(shù)量少，再生能力低，較難滿足胰腺損傷修復(fù)需求。而骨髓MSC取材方便，數(shù)量多，易培養(yǎng)，可分化成胰腺、血管、神經(jīng)細(xì)胞等組織細(xì)胞，達(dá)到治療目的，還能經(jīng)由對(duì)SAP時(shí)過(guò)度炎癥反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，控制炎癥因子釋放，減輕胰腺損傷[21]。報(bào)道[17]發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC可在體內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成胰腺干細(xì)胞，進(jìn)行再生、自我修復(fù)，減輕胰腺組織損傷。還有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[22]表明，經(jīng)腹腔與尾靜脈聯(lián)合注射骨髓MSC，在控制SAP大鼠炎癥細(xì)胞因子上效果顯著，但并未就其作用機(jī)制進(jìn)行深入分析。本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC治療后IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA及血清AMS、LPS水平降低，SOA升高，聯(lián)合注射組改善更顯著，說(shuō)明骨髓MSC腹腔聯(lián)合尾靜脈注射移植可減輕SAP大鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解病情。進(jìn)一步分析胰腺組織病理形態(tài)學(xué)變化，還發(fā)現(xiàn)骨髓MSC腹腔聯(lián)合尾靜脈注射移植可減輕SAP大鼠胰腺組織損傷。傅明杰等[23]也發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC經(jīng)腹腔與尾靜脈聯(lián)合注射可促使SAP大鼠胰腺病理評(píng)分降低，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、出血、水腫等，減輕炎癥反應(yīng)，但具體作用機(jī)制仍未明確。

TLR4/p-NF-κBp65通路在SAP炎癥反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，基因通常包括TLR4、MyD88、NF-κB3種[24-25]。NF-κB是一種蛋白質(zhì)因子，能對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行調(diào)控，且可結(jié)合細(xì)胞因子、黏附因子等基因啟動(dòng)子，促進(jìn)基因表達(dá)，而NF-κBp65為NF-κB激活后主要存在方式[26-27]。胰腺細(xì)胞表面TLR4分布較多，一旦胰腺受缺血、感染、損傷等因素刺激，可激活TLR4，并經(jīng)胞內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)引發(fā)MyD88、NF-κB活化，對(duì)NF-κB上游IκB進(jìn)行激活，使得p65進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控較多炎性細(xì)胞因子表達(dá)[28]。相關(guān)報(bào)道[29]顯示，抑制TLR4/p-NF-κBp65通路，能對(duì)SAP小鼠胰腺組織產(chǎn)生保護(hù)作用，減輕胰腺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓MSC能促使TLR4、MyD88 mRNA相對(duì)表達(dá)量及TLR4、MyD88白表達(dá)量降低，p-NF-κBp65/ NF-κBp65比值下降，且腹腔聯(lián)合尾靜脈注射移植給藥時(shí)改善效果更顯著，這說(shuō)明骨髓MSC腹腔聯(lián)合尾靜脈注射可有效抑制TLR4/NF-κBp65通路，這可能是其抑制SAP大鼠炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，修復(fù)胰腺組織損傷的一個(gè)重要作用機(jī)制。

綜上所述，骨髓MSC腹腔聯(lián)合尾靜脈注射能抑制SAP大鼠炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，緩解胰腺組織損傷，作用機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κBp65通路有關(guān)。但本研究也存在不足之處，比如涉及的樣本量較少，且骨髓MSC抑制SAP大鼠炎癥反應(yīng)是否存在其他方面機(jī)制尚不明確，今后仍需深入分析。