張波，徐濤，徐浩，夏雨，周文策，

（1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 普通外科，甘肅 蘭州 730000）

胰腺腺癌（pancre atic a denocarcinoma，PAAD）是最常見的胰腺腫瘤，占所有胰腺癌的絕大多數(shù)；由于其早期診斷困難，超過(guò)52%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者確診在晚期，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，對(duì)放化療敏感度又差，5年生存率不足10%[1-3]。因此，尋找PAAD早期診斷和治療的新靶點(diǎn)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

基因改變對(duì)PAAD 的發(fā)病至關(guān)重要，研究PAAD發(fā)生的分子機(jī)制是延長(zhǎng)患者總生存期的關(guān)鍵。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)胰腺癌敏感度強(qiáng)、特異度高的腫瘤標(biāo)記物，也沒(méi)有找到有效的治療靶點(diǎn)[4]。單基因?qū)δ[瘤的診斷效果多不理想，局限性較大，多基因聯(lián)合檢測(cè)有望在診斷領(lǐng)域開辟新方向。支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）是機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域中一種重要的分類算法，它通過(guò)估計(jì)每個(gè)樣本的內(nèi)部聯(lián)系和規(guī)則來(lái)判別樣本類型，具有較高的分類精度[5]。隨著生物信息技術(shù)的發(fā)展，基因芯片可快捷、高效地分析多個(gè)基因聯(lián)合檢測(cè)對(duì)腫瘤的診斷效能。為了探究PAAD的發(fā)病機(jī)理，本研究從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）中下載了3個(gè)芯片，篩選PAAD組織和正常組織之間的差異表達(dá)基因（differentially expression genes，DEGs），對(duì)這些DEGs 進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析，并通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（proteinprotein interaction network，PPI）分析和關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析篩選出候選基因，探討可能與PAAD診斷和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，并構(gòu)建分類PAAD和正常樣本的SVM模型，為以后研究PAAD的診治和分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)下載及預(yù)處理

從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載3個(gè)PAAD基因表達(dá)譜芯片（GSE28735、GSE62165、GSE62452）；數(shù)據(jù)集GSE28735和GSE62452基于GPL6244 Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array，而GSE62165芯片數(shù)據(jù)在GPL13667 Affymetrix Human Genome U219 Array平臺(tái)上注釋。其中GSE28735包括45例PAAD樣本和45例正常組織樣本；GSE62452含有69例PAAD樣本和61例正常組織樣本；GSE62165包括118例PAAD樣本和13例正常組織樣本。整理數(shù)據(jù)集中的樣本分組及臨床相關(guān)信息，并對(duì)表達(dá)譜按芯片注釋信息進(jìn)行重注釋。從UCSC Xena下載得到癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌的生存數(shù)據(jù)和基因表達(dá)譜，并對(duì)表達(dá)譜進(jìn)行Log2（count+1）的標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除量綱差異。

1.2 DEGs 的篩選

芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用R語(yǔ)言Limma包[6]進(jìn)行PAAD組織和正常組織的差異基因分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log FC|＞1和P＜0.05；通過(guò)Venn圖得到3個(gè)芯片交集的DEGs，其中在3個(gè)芯片中均上調(diào)的基因作為上調(diào)DEGs，均下調(diào)的基因作為下調(diào)DEGs。

1.3 DEGs 的GO 分析和KEGG 分析

將得到的DEGs上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.string-db.org）中進(jìn)行GO分析（包括生物學(xué)過(guò)程BP、細(xì)胞組分CC、分子功能MF）和KEGG通路富集分析，分析參數(shù)采用數(shù)據(jù)庫(kù)默認(rèn)，并將TOP10的顯著富集結(jié)果以氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.4 DEGs 的PPI 分析及關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行PPI分析[7]，蛋白互作的combined score＞0.4作為閾值條件，再通過(guò)Cytoscape軟件（http://cytoscape.org）對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化[8]。利用Cytoscape軟件中的MCODE插件識(shí)別該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，參數(shù)設(shè)置為：Degree Cutoff=2，Node Score Cutoff=0.2，Max.Depth=100，K-Core=2，MCODE score≥5。

1.5 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選及其功能富集分析

數(shù)據(jù)集GSE28735和GSE62452的臨床信息中包含生存信息，將所有關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)中包含的基因以及PPI分析結(jié)果中度值（degree）≥15的基因，分別在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中使用R 語(yǔ)言的survival 包進(jìn)行生存分析，將在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中都具有顯著生存意義（P＜0.05）的基因作為關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。將得到的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)上傳至Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)[9]進(jìn)行功能富集 分析。

1.6 最優(yōu)特征基因的篩選和及其表達(dá)驗(yàn)證

遞歸特征消除（recursive feature elimination，RFE）是一種貪婪的算法，通過(guò)重復(fù)構(gòu)建模型篩選出分類的最佳基因組合[10]。為了進(jìn)一步縮小候選基因的范圍，準(zhǔn)確識(shí)別最優(yōu)特征基因，將數(shù)據(jù)集GSE28735作為訓(xùn)練集，其他兩個(gè)數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證集。在訓(xùn)練集中，利用R語(yǔ)言caret包中的RFE算法從關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)里篩選出最優(yōu)特征基因組合。在10倍交叉驗(yàn)證中，以均方根誤差（RMSE）最小、準(zhǔn)確率最高的基因組合為最佳基因組合。由于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中正常胰腺樣本較少，故在GEPIA[11]數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)最優(yōu)特征基因的差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，篩選條件為|log2FC|＞1和P＜0.01。

1.7 SVM 模型的構(gòu)建及驗(yàn)證

為探索8 個(gè)最優(yōu)特征基因聯(lián)合檢測(cè)在分類PAAD和正常樣本中的作用，使用 R 語(yǔ)言e1071 包[12]構(gòu)建基于這些基因的SVM模型，最終選擇參數(shù)為SVM-Type：eps-regression；SVM-Kernel：radial；cost：1；gamma：0.125；epsilon：0.1，并在訓(xùn)練集GSE28735 和驗(yàn)證集（GSE6216 5 和GSE62452）中采用R 語(yǔ)言 pROC包[13]繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線對(duì)該模型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.8 最優(yōu)特征基因的預(yù)后分析

將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的PAAD的樣本挑選出來(lái)，剔除正常樣本，對(duì)缺乏生存信息的樣本刪除，使用R語(yǔ)言survminer包[14]計(jì)算每個(gè)最優(yōu)特征基因的最佳截?cái)嘀担╫ptimal cutoff），對(duì)于mRNA表達(dá)值＞optimal cutoff視為高表達(dá)，≤optimal cutoff作為低表達(dá)，結(jié)合生存時(shí)間和生存狀態(tài)進(jìn)行生存分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs 的篩選

通過(guò)對(duì)GSE28735、GSE62452、GSE62165數(shù)據(jù)集的分析，分別鑒定出388個(gè)（243個(gè)上調(diào)，145個(gè)下調(diào)）、283個(gè)（185個(gè)上調(diào)，98個(gè)下調(diào)）和3063個(gè)（1993個(gè)上調(diào)，1070個(gè)下調(diào)）差異基因。韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)257個(gè)DEGs均在3個(gè)數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)，其中168個(gè)為上調(diào)DEGs，89個(gè)是下調(diào)DEGs（圖1）。

圖1 DEGs 的Venn 圖 A：上調(diào)DEGs；B：下調(diào)DEGsFigure 1 Venn diagram of DEGs A: Up-regulated DEGs; B: Down-regulated DEGs

2.2 DEGs 的功能和通路富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示：257個(gè)DEGs主要參與BP的細(xì)胞外基質(zhì)的組成、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組成、細(xì)胞黏附、組織發(fā)育等過(guò)程；CC主要聚集于細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外區(qū)域部分、細(xì)胞外間隙等；MF主要與絲氨酸肽酶活性、絲氨酸內(nèi)肽酶活性、肽酶活性等有關(guān)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要參與蛋白質(zhì)的消化和吸收、胰腺的分泌、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、黏著斑、PI3K-Akt信號(hào)通路等（均P＜0.05）（圖2）。

2.3 PPI 及關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建257個(gè)DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape進(jìn)行可視化，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共有210個(gè)節(jié)點(diǎn)和822條邊（圖3）。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選出29個(gè)度值≥15的重要基因（表1）。利用MCODE插件篩選出4個(gè)關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)（圖4）。結(jié)合關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)一些新的在PAAD的進(jìn)展中起調(diào)控作用的基因，如COL5A2、OAS2、DDX60、CELA2A，這為以后研究PAAD的分子機(jī)制提供更多的依據(jù)。

圖2 257 個(gè)DEGs 的功能和通路富集氣泡圖Figure 2 Function and pathway enrichment bubble graph of 257 DEGs

圖3 PPI 圖（紅色為上調(diào)基因，綠色為下調(diào)基因）Figure 3 PPI (red color showing the up-regulated genes, and green color showing the down-regulated genes)

表1 篩選出度值≥15 的29 個(gè)基因Table 1 29 screened genes with a degree ≥ 15

圖4 關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析（包括4 個(gè)模塊）Figure 4 Key sub-module analysis of the PPI (including 4 modules)

2.4 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其功能富集分析

4 個(gè)關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)包含的所有基因及PPI網(wǎng)絡(luò)中degree≥15的基因共有52個(gè)。將這52 個(gè)基因分別在數(shù)據(jù)集 GSE62452和GSE28735中進(jìn)行生存分析，分別得到26 個(gè)和22 個(gè)與PAAD 預(yù)后相關(guān)的基因（P＜0.05），其中14個(gè)基因（ANLN、BGN、CENPF、DDX60、FN1、IFI44L、ITGA3、LAMA3、MET、MKI67、MMP14、OAS2、PLAU、TOP2A）在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中均與預(yù)后相關(guān)（圖5A）。利用Metascape對(duì)這14個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在腫瘤侵犯和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮一定作用（圖5B）。

圖5 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的篩選及其功能富集分析 A：Venn 示GSE62452 和 GSE28735 數(shù)據(jù)集中與預(yù)后相關(guān)基因的交叉驗(yàn)證結(jié)果； B：Metascape 對(duì)14 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行的功能和通路富集分析結(jié)果Figure 5 Screening of key nodes and function enrichment analysis A: The Venn diagram showing the result of cross-validation of prognostic related genes in the GSE62452 and GSE28735 datasets; B: Function and pathway enrichment analysis of 14 key nodeSBy using Metascape

2.5 最優(yōu)特征基因及其表達(dá)驗(yàn)證

在最優(yōu)參數(shù)（最小RMSE=0.3429，最大準(zhǔn)確度=0.8694）下，用RFE算法篩選出8個(gè)最優(yōu)特征基因：LAMA3、FN1、ITGA3、MET、PLAU、CENPF、MMP14、OAS2（圖6）。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這8 個(gè)最優(yōu)特征基因在PAAD 組織中的表達(dá)均高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.6 SVM 模型及其驗(yàn)證

通過(guò)R語(yǔ)言e1071包構(gòu)建8個(gè)最優(yōu)特征基因診斷PAAD的SVM建模如圖7所示，該模型在訓(xùn)練集GSE28735中的曲線下面積（AUC）為0.898，靈敏度和特異度均為0.911；在驗(yàn)證集GSE62452中的AUC為0.905，敏感度為0.855，特異度為0.918；在驗(yàn)證集GSE62165中的AUC為1，敏感度和特異度均為1；表明該SVM模型可以較好地區(qū)分PAAD和正常樣本。

圖6 最優(yōu)特征基因組合的準(zhǔn)確度曲線（橫軸代表基因變量的數(shù)量，縱軸代表交叉驗(yàn)證的準(zhǔn)確性，點(diǎn)標(biāo)記是最優(yōu)特征基因組合對(duì)應(yīng)的基因數(shù)）Figure 6 Accuracy curve for screening the optimal feature gene combination (the horizontal axis representing the number of gene variables, the vertical axis representing the cross-validation accuracy, and the marked content standing for the number of genes corresponding to the optimal gene combination)

圖7 訓(xùn)練集（GSE28735）及驗(yàn)證集（GSE62165 和GSE62452）對(duì)SVM 模型的ROC 曲線Figure 7 ROC curves of the training set (GSE28735) and the validation sets (GSE62165 and GSE62452) on the SVM classifier

2.7 最優(yōu)特征基因的生存分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出178例PAAD樣本，Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)，與高表達(dá)LAMA3、ITGA3、MET、PLAU、CENPF及OAS2組的PAAD患者相比，這些基因的低表達(dá)組總生存率更長(zhǎng)（均P＜0.05）（圖8），而FN1、MMP14上調(diào)對(duì)PAAD的生存率無(wú)明顯影響（均P＞0.05）。

圖8 基于最佳截?cái)嘀颠M(jìn)行的TCGA 中最優(yōu)特征基因與PAAD 關(guān)系的生存分析Figure 8 Survival analysis of the relationship between optimal feature genes and PAAD in TCGA database based on the optimal cutoff

3 討 論

盡管PAAD的治療已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但由于缺乏準(zhǔn)確診斷PAAD的特異度生物標(biāo)志物及個(gè)體化治療的有效靶點(diǎn)，PAAD仍然是一種難治性癌 癥[15]。探索PAAD的分子機(jī)制，找出潛在的診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物，具有重要意義。在本研究中，從GSE28735、GSE62165及GSE62452數(shù)據(jù)集中篩選出257個(gè)在胰腺癌和正常組織之間的DEGs，其中168個(gè)上調(diào)DEGs和89個(gè)下調(diào)DEGs。通過(guò)GO和KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些DEGs主要參與的細(xì)胞外基質(zhì)[16]、細(xì)胞黏附[17]、細(xì)胞遷移[18]、胰腺的分泌[19]、PI3K-Akt信號(hào)通路[20]已被證明與PAAD的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，表明本研究篩選的DEGs可靠性高。PPI預(yù)測(cè)和關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)一些新的在PAAD進(jìn)展中起調(diào)控作用的基因，如COL5A2、OAS2、DDX60、CELA2A。既往研究發(fā)現(xiàn)這些基因與疾病的發(fā)生或治療密切相關(guān)[21-24]，如DDX60的表達(dá)可調(diào)節(jié)乳腺癌患者對(duì)放療的敏感度[23]，CELA2A突變與代謝綜合征的發(fā)生相關(guān)[24]等；但他們?cè)赑AAD中尚無(wú)相關(guān)研究，這為以后研究PAAD的分子機(jī)制提供了參考。數(shù)據(jù)集中的生存分析篩選到14個(gè)與生存相關(guān)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，這些基因參與腫瘤的發(fā)生和侵犯，值得進(jìn)一步研究。由遞歸特征消除算法篩選到8個(gè)最優(yōu)特征基因，經(jīng)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)這8個(gè)最優(yōu)特征基因在PAAD組織中的表達(dá)高于正常組織，與芯片結(jié)果一致。鑒于單個(gè)靶點(diǎn)對(duì)腫瘤診斷價(jià)值有限，本研究通過(guò)R語(yǔ)言的e1071包對(duì)8個(gè)最優(yōu)特征基因構(gòu)建SVM模型，ROC曲線驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)3個(gè)數(shù)據(jù)集的AUC均在0.85以上，敏感度和特異度高。據(jù)我們所知，用于PAAD診斷的SVM模型以前很少有報(bào)道，本研究構(gòu)建的SVM模型可有效區(qū)分PAAD樣本和正常樣本，有望用于臨床實(shí)踐。

在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中驗(yàn)證8 個(gè)最優(yōu)基因的預(yù)后價(jià)值，其中CENPF、ITGA3、LAMA3、MET、OAS2、PLAU與PAAD患者的預(yù)后有關(guān)，即基因高表達(dá)者預(yù)后差、基因低表達(dá)者總生存率更長(zhǎng)；該6個(gè)基因被視為關(guān)鍵基因。既往研究表明，ITGA3、LAMA3、CENPF在胰腺癌組織中高表達(dá)，且這些基因高表達(dá)的胰腺癌患者預(yù)后更差[25-27]，這與本研究結(jié)果一致。Jiao等[25]證實(shí)，ITGA3對(duì)胰腺癌的早期診斷有一定價(jià)值，其表達(dá)水平與組織學(xué)類型、生存狀態(tài)以及復(fù)發(fā)相關(guān)。腫瘤間質(zhì)相互作用是腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。研究[28]表明ITGA3是PAAD腫瘤間質(zhì)相互作用的靶點(diǎn)之一，靶向ITGA3可能是PAAD治療的潛在方法。Yang等[26]指出LAMA3不僅與PAAD 患者的預(yù)后有關(guān)，還有診斷PAAD的潛力。研究[29]發(fā)現(xiàn)LAMA3的沉默可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，是PAAD潛在的治療靶點(diǎn)。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)CENPF的表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及有絲分裂G2/M的轉(zhuǎn)化，這種調(diào)節(jié)與TNF信號(hào)通路有關(guān)。PLAU可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，參與細(xì)胞的侵襲和遷移。雷公藤甲素通過(guò)下調(diào)PLAU抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移，在此過(guò)程中，EMT信號(hào)通路被激活[30]。MET是受體酪氨酸激酶家族成員，包含MET的9個(gè)基因組合可有效預(yù)測(cè)PAAD患者的預(yù)后[31]。然而，這些關(guān)鍵基因在PAAD中的具體作用機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。OAS2是2'，5'-寡腺苷酸合成酶中一員，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[32]；而在乳腺癌中，OAS2高表達(dá)的患者預(yù)后較好[22]，這與本研究OAS2對(duì)PAAD的預(yù)后存異?？梢?，OAS2在不同腫瘤中的作用并不一致，目前缺乏OAS2在PAAD中的研究，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)研究OAS2在PAAD中的具體作用。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析尋找可能參與PAAD發(fā)病的DEGs，通過(guò)對(duì)這些DEGs進(jìn)行分析，以更好地了解PAAD致癌的機(jī)制。研究結(jié)果顯示，COL5A2、OAS2、DDX60、CELA2A為探究PAAD的分子機(jī)制提供新路經(jīng)；關(guān)鍵基因LAMA3、ITGA3、MET、PLAU、CENPF、OAS2可能成為PAAD診斷或治療的新靶點(diǎn)；基于8個(gè)最優(yōu)特征基因構(gòu)建的SVM模型可有效診斷PAAD。本研究為今后研究PAAD的分子機(jī)制、生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)提供了新的思路。然而，該研究的主要局限性是缺乏基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)這些結(jié)果的真實(shí)性，分析結(jié)果的可靠性嚴(yán)重依托于本報(bào)告中涉及數(shù)據(jù)集的準(zhǔn)確性。未來(lái)的研究應(yīng)通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐來(lái)驗(yàn)證本研究的結(jié)果。