陳瑤瑤,趙曉南，孫艷紅，張美玲，周潔楠

基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)是披膜病毒科甲病毒屬的單股正鏈RNA病毒，主要通過白紋伊蚊和埃及伊蚊叮咬傳播[1]。1952年，在坦桑尼亞首次檢測到CHIKV[2]，隨后在烏干達和許多其他撒哈拉以南非洲國家均發(fā)現(xiàn)了CHIKV，在過去的5年里，更是以驚人的速度擴散到亞洲、非洲、歐洲和美洲的100多個國家，成為日益嚴重的全球健康威脅[3]。1986年云南省從蝙蝠腦組織中分離出一株CHIKV毒株[4]，這是我國首次分離得到CHIKV毒株，2008年在廣東出現(xiàn)了首例輸入性基孔肯雅熱病例[5]，隨后在我國的其他地方不斷出現(xiàn)輸入性病例和本地疫情[6-8]。云南省位于中國西南邊陲，與多個東南亞國家接壤，經(jīng)濟貿(mào)易往來及國際間旅行日益頻繁, 存在極大輸入性風險，再加上豐富多樣的氣候類型，適合伊蚊生存繁殖的自然地理環(huán)境[9]，云南省基孔肯雅熱流行風險正在加劇。2019年6月，通過流行病學調(diào)查及實驗室檢測，云南省確診1例基孔肯雅熱輸入性病例，本研究通過對CHIKV進行分離培養(yǎng)和全基因組測序，分析病毒遺傳進化趨勢及氨基酸位點變異情況，為云南省防控基孔肯雅熱提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標本來源 2019年6月27日采集得到1名緬甸仰光飛抵昆明長水機場的旅客血清，送至云南省疾病預防控制中心排查基孔肯雅熱。

1.2核酸提取及real-time RT-PCR檢測 采用江蘇碩世全自動核酸提取儀和病毒核酸提取試劑盒(貨號：SDK60104)進行核酸提取，病毒核酸檢測使用基孔肯雅病毒檢測試劑盒(江蘇碩世，貨號：JC40104)，具體反應體系和反應條件參照試劑盒說明書。

1.3病毒分離培養(yǎng) 將患者血清接種于80%單層非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附2 h后，加入含有2%胎牛血清、7.5%碳酸氫鈉及雙抗的維持液(維持液基質(zhì)DMEM)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。每日觀察病變情況。收獲盲傳第2代72 h培養(yǎng)物進行后續(xù)實驗。

1.4測序引物 設計參考相關文獻[8]，合成基孔肯雅全基因組擴增引物，對CHIKV進行分段擴增，以便后續(xù)測序。引物由昆明擎科生物公司合成。

1.5全基因組測序 使用TAKARA One Step RT-PCR試劑盒(貨號：RR057)對病毒核酸進行擴增，反應體系：2×1 step Buffer 12.5 μL，1 step Enzyme mix 1 μL，F(xiàn)orward Primer(10 μmol/L)1.5 μL，Reverse Primer(10 μmol/L)1.5 μL，無酶水6 μL，模板2.5 μL，反應體系總體積25 μL。反應程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2.5 min，共30個循環(huán)，72 ℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，陽性擴增產(chǎn)物送至昆明擎科生物公司進行測序。

1.6序列拼接和系統(tǒng)進化發(fā)生樹構建及分析 使用DNAStar 7.1軟件對測序結果進行拼接，在NCBI上下載參考株序列，通過Mega5.0軟件對序列進行比對和系統(tǒng)發(fā)生樹構建。采用Neighbor-joining法構建進化樹，bootstrap值設置為1 000。

2 結 果

2.1流行病學調(diào)查 患者趙某，男，43歲，云南人。在緬甸經(jīng)商，經(jīng)常往返于昆明-仰光?；颊哂?019年1月前往仰光，2019年6月26日返回昆明，期間當?shù)赜形脗骷膊∩l(fā)，自述有蚊蟲叮咬史。

2.2Real-time RT-PCR檢測 病例血清標本核酸檢測顯示CHIKV陽性，Ct值為15.73。

2.3病毒分離鑒定 將1代細胞培養(yǎng)物接種細胞后，觀察細胞病變情況，細胞逐漸融合、堆聚，在72 h后病變達到80%，將細胞板置于-70 ℃冰箱。反復凍融2次，取200 μL融解后的培養(yǎng)物進行核酸提取及病毒核酸檢測。Real-time RT-PCR結果顯示CHIKV陽性，Ct值為9.14。見圖1。

圖1 CHIKV感染Vero細胞病變情況Fig.1 Cytopathogenic effects after Vero cells infection with CHIKV

2.4全基因組測序 對測序數(shù)據(jù)進行拼接處理后獲得CHIKV全基因組序列，命名為YN0627，全長為11 586 nt，其基因結構符合CHIKV的基因特征，基因組內(nèi)包含兩個完整的編碼框，分別編碼4個非結構蛋白(nsP1-nsP2-nsP3-nsP4)和5個結構蛋白(C-E3-E2-6K-E1)，兩個編碼框之間有一個非編碼的連接區(qū)，長度為65個核苷酸。非結構蛋白編碼區(qū)共包含7 425個核苷酸，編碼2 474個氨基酸；結構蛋白編碼區(qū)共包含3 747個核苷酸，編碼1 248個氨基酸，均不存在堿基的插入和缺失。5′端起始的76個核苷酸和3′端273個核苷酸為非編碼區(qū)。

2.5全基因組進化分析 通過對YN0627的全基因組以及編碼區(qū)進行BLAST N檢索，得到序列相似度最高的均為CHIKV。將YN0627的基因組編碼區(qū)與選取的參考序列進行多重比對，系統(tǒng)進化分析顯示YN0627與來自泰國的MN630017、MK468801、來自中國的MH400249、來自孟加拉的MF773566等毒株關系密切，并與東中南非洲遺傳譜系(East, Central and South African Lineage, ECSA)的其他流行株聚集在一起，顯示出緊密的進化相關性，見圖2。與ECSA譜系內(nèi)的參考序列進行多重比對，YN0627的編碼區(qū)與參考序列相比，核苷酸同源性為85.24%～99.96%，氨基酸同源性為95.34%～99.97%；與非洲原型株S27比較，核苷酸同源性為97.33%，氨基酸同源性為98.53%。

圖2 CHIKV-YN0627系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogeny of CHIKV-YN0627

2.6基因位點分析 在YN0627的 5個結構蛋白的編碼區(qū)域中，一共觀察到28個氨基酸變異位點。未觀察到E1中的對白紋伊蚊的適應性突變A226V，但是有E1：D284E、E1：K211E、E2：V264A和E2：I211T突變，其他一些位點，例如可能影響氨基酸pH值的E2：K252Q[5]沒有被觀察到；E2蛋白上兩個重要糖基化抗原位點263N和345N呈高度保守[10]，見表1。

3 討 論

系統(tǒng)進化分析通過不同的地理位置將CHIKV分為3個遺傳譜系：東中南非洲(ESCA)譜系、亞洲(Asian)譜系和西非(West Africa)譜系。從本研究的系統(tǒng)進化分析結果來看，YN0627與東南亞各國毒株關系密切，屬于ESCA遺傳譜系，與流行病學調(diào)查資料結果相一致，是來自東南亞國家緬甸的輸入性病例。中國分離得到大部分基孔肯雅毒株都屬于輸入型的，因此國內(nèi)各毒株間進化關系并不是特別密切，但是我們依舊需要對該病毒進行密切關注和更加深入的研究，特別應該關注能夠增強病毒毒力和適應性突變的位點。

表1 CHIKV YN0627結構蛋白氨基酸變異位點分析Tab.1 Amino acid variation sites in the structural protein of CHIKV-YN0627

CHIKV共編碼4個非結構蛋白和5個結構蛋白，非結構蛋白不會包裝到最終病毒體中，結構蛋白才是宿主體液免疫應答和大多數(shù)疫苗的關鍵靶點[11]，因此本研究著重對結構蛋白的氨基酸變異位點進行分析。分析結果發(fā)現(xiàn)YN0627沒有E1：A226V的突變，而觀察到了E1：K211E、E1：D284E、E2：V264A和E2：I211T突變。E1：A226V突變在2005年首次被發(fā)現(xiàn)，該位點的突變能夠提高CHIKV在白紋伊蚊中的適應性[12]，在東南亞白紋伊蚊為優(yōu)勢種群的多個地區(qū)，都分離到了有E1：A226V突變的CHIKV毒株[13]。但是有研究證明，在E1：226A的基礎上引入E1：K211E和E2：V264A的突變，能使CHIKV在感染埃及伊蚊14天后，其體內(nèi)的滴度成倍數(shù)增長：在中腸中增加13倍，在腿和翅膀中增加15倍，在唾液中增加62倍[14]。有學者在云南省邊境地州開展蚊媒媒介的相關監(jiān)測和研究，結果表明，白紋伊蚊在云南省內(nèi)分布廣泛，但是近年來埃及伊蚊的分布區(qū)域呈現(xiàn)出逐漸擴大的趨勢，埃及伊蚊孳生優(yōu)勢較白紋伊蚊明顯，有取代白紋伊蚊成為優(yōu)勢種及不斷向周邊區(qū)域擴散和定殖的分布趨勢[15-16]，綜合分離株YN0627中存在E1：226A的基礎上的E1：K211E和E2：V264A，文獻實驗數(shù)據(jù)顯示這些突變能夠提高CHIKV對埃及伊蚊的適應性，提示云南省應當加強對CHIKV的監(jiān)測和研究。

在YN0627中還觀察到了E1：D284E和E2：I211T突變，E1：D284E對膜融合和病毒體的裝配有很重要的作用[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，E2：I211T突變在最近發(fā)現(xiàn)的ESCA譜系中普遍存在，這表明E2：I211T的突變對于CHIKV適應ECSA流行區(qū)域普遍存在的某些特定條件非常重要[17]。我們還觀察到了結構蛋白上的其他變異如C：P23S，C：V27I，E3：I23T，6K：V8I，E1：M269V等等，但是這些位點對病毒功能的影響尚不清楚。

基于我國的基孔肯雅熱疫情一直以輸入性的散發(fā)病例為主，國內(nèi)人群缺乏免疫力，普遍易感，且目前尚無有效的疫苗和抗病毒藥物，做好對CHIKV感染源頭的防控，即防蚊滅蚊工作至關重要。還需加強重點人群宣教，到高風險地區(qū)旅居的人應采取基本的防蚊措施，返回時如感不適，就醫(yī)時應主動提供自身旅居史。同時需加強醫(yī)務人員培訓，提高醫(yī)務人員對疾病的識別能力和對傳染病的敏感性，防止本地病例的產(chǎn)生。

利益沖突：無