顏明智，李錦田，劉 輝，庫(kù)爾班尼沙·阿馬洪，呂國(guó)棟，趙 軍

（1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2臨床醫(yī)學(xué)研究院，3臨床藥學(xué)科，烏魯木齊830054）

囊型包蟲(chóng)病是一種由細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcusgranulosus）的幼蟲(chóng)引起的人畜共患的慢性寄生蟲(chóng)病，對(duì)于發(fā)展中國(guó)家仍然是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。目前治療包蟲(chóng)病的主要手段有手術(shù)治療和藥物治療，但是手術(shù)治療存在高風(fēng)險(xiǎn)、易復(fù)發(fā)等問(wèn)題，對(duì)于無(wú)法手術(shù)治療的患者，只能采用藥物療法[3]。阿苯達(dá)唑是世界衛(wèi)生組織首推的包蟲(chóng)藥物，但該藥物存在生物利用度低、副作用多并缺乏殺蟲(chóng)能力，治療效果無(wú)法令人滿(mǎn)意[4]，因而亟需篩選和開(kāi)發(fā)新的包蟲(chóng)藥物靶點(diǎn)。生物信息學(xué)分析技術(shù)具有高效率、低成本的特點(diǎn)，在藥物靶點(diǎn)、疫苗候選分子等篩選上具有顯著的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)逐漸成為一種熱門(mén)技術(shù)，為包蟲(chóng)病的防治提供了新的研究策略。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種異三聚體復(fù)合物，由催化α亞基（α1和α2）、支架β亞基（β1和β2）和調(diào)節(jié)γ亞基（γ1、γ2和γ3）構(gòu)成[5]。作為能量穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)器，AMPK通過(guò)調(diào)控葡萄糖和脂肪酸等多種代謝途徑以平衡細(xì)胞的能量狀態(tài)，在能量代謝調(diào)節(jié)方面起到關(guān)鍵性作用[6]。當(dāng)病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)等病原體入侵宿主后會(huì)對(duì)宿主的AMPK產(chǎn)生不同的影響（激活或抑制AMPK），以滿(mǎn)足自身的生長(zhǎng)發(fā)育條件[7-8]。AMPK主要通過(guò)3種互補(bǔ)效應(yīng)激活：上游激酶促進(jìn)蘇氨酸172位點(diǎn)（Thr172）磷酸化；蛋白磷酸酶抑制Thr172去磷酸化；變構(gòu)激活[9]。而Thr-172位于α-亞基N-末端的絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)，該位點(diǎn)的磷酸化是其激酶活性所必需的[10]。因此AMPKα對(duì)AMPK活性調(diào)節(jié)起到了重要作用，是一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)。此外，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)中存在獨(dú)立于宿主的AMPK信號(hào)通路，這為針對(duì)EgAMPK設(shè)計(jì)專(zhuān)一性的靶向藥物提供了可能。但目前對(duì)EgAMPKα結(jié)構(gòu)研究較為匱乏，EgAMPKα的藥物對(duì)接位點(diǎn)鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析了EgAMPKα序列和編碼基因的理化特性，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并通過(guò)3D分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)了AMPK激動(dòng)劑對(duì)接位點(diǎn)，為理解細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的生物學(xué)功能及其包蟲(chóng)藥物靶點(diǎn)的篩選提供了參考。

1 材料與方法

1.1 序列檢索 從NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/）中 獲 得EgAMPKα（GenBank：AER10553.1）、EmAMPKα（GenBank ID：AER10552.1）、SmAMPKα（GenBank ID：AZB50365.2）、CsAMPKα2（GenBank ID：GAA51741.1）、CeAMPKα1（GenBank ID：AAR06928.1）、BmAMPKα（GenBank ID：ABQ62953.1）、ClAMPKα1（GenBank ID：PKK20873.1）、SsAMPKα2（GenBank ID：ACL80207.1）、DrAMPKα1（GenBank ID：NP_001103756.1）、MmAMPKα1（Gen-Bank ID：AAW79567.1）、HsAMPKα2（GenBank ID：NP_006243.2）的基因序列。

1.2 EgAMPKα生物信息學(xué)分析 利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/）對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)及其模式生物AMPKα的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性指數(shù)等生理生化特性進(jìn)行預(yù)測(cè)[11]。利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)EgAMPKα親水性[11]。利 用SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測(cè)EgAMPKα信號(hào)肽[12]。利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù) 測(cè) 分 析EgAMPKα的跨膜區(qū)域[13]。利用Motif Scan（https://my-hits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan）分析EgAMPKα翻譯后修飾位點(diǎn)[14]。利用ProtComp 9.0（http://www.softberry.com/berry.phtml? topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）預(yù) 測(cè)亞細(xì)胞定位[15]。通過(guò)CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/?term=）分析EgAMPKα的結(jié)構(gòu)域[16]。通過(guò)SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析EgAMPKα二級(jí)結(jié)構(gòu)，并利用DNAStar對(duì)EgAMPKα柔性區(qū)、表面可及區(qū)和抗原指數(shù)進(jìn)行分析[17]。利用Swiss-Model（https://swissmodel.expasy.org/interactive）對(duì)EgAMPKα和HsAMPKα2序列進(jìn)行同源建模。使用Verify 3D（https://servicesn.mbi.ucla.edu/Verify3D/）對(duì)EgAMPKα的3D模型進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)ZICN15數(shù)據(jù)庫(kù)（http://zinc.docking.org/）檢索獲取二甲雙胍的3D結(jié)構(gòu)[18]，并利用Autodock（Version 4.2.6）軟件將EgAMPKα和HsAMPKα2的3D模型通與二甲雙胍的3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)Py-MOL（Version 2.4）軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行三維圖顯示。使用DNAMAN軟件（Version 5.2.2）對(duì)EgAMPKα及其同源基因進(jìn)行多序列比對(duì)分析。利用MEGA軟件（Version 10.0.5）建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 EgAMPKα的生理生化特征EgAMPKα化學(xué)式為C2467H3882N678O687S21，包含478個(gè)氨基酸，分子量為54 705.35Da，等電點(diǎn)為8.40，脂肪族氨基酸指數(shù)為93.35，不穩(wěn)定指數(shù)是46.48，是一種不穩(wěn)定亞基。EgAMPKα包含多個(gè)親水性區(qū)域，親水性平均系數(shù)為-3.311～2.522，親水性的總平均值(GRAVY)為-0.225，屬于親水性亞基（表1）。

表1 EgAMPKα及其同源基因的生理生化特征

2.2 EgAMPKα的信號(hào)肽和跨膜區(qū)域EgAMPKα的信號(hào)肽(Sec/SPI)為0.000 4，無(wú)信號(hào)肽裂解位點(diǎn)，也不存在跨膜區(qū)域。

2.3 EgAMPKα的翻譯后修飾位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位EgAMPKα中有3個(gè)N端糖基化位點(diǎn)（位于304～307，437～440，450～453氨基酸區(qū)段），2個(gè)cAMP和cGMP依賴(lài)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（位于259～262，445～448氨基酸區(qū)段），10個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)（位于11～14，89～92，101～104，116～119，129～132，244～247，262～265，290～293，306～309，435-438氨基酸區(qū)段），3個(gè)N端豆蔻?；稽c(diǎn)（位于37～42，43～48，130～135氨基酸區(qū)段），6個(gè)蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn)（位于4～6，112～114，116～118，190～192，244～246，306～308氨基酸區(qū)段）。通過(guò)ProtCompv.9.0預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明EgAMPKα的亞細(xì)胞定位分布部位是質(zhì)膜。

2.4 EgAMPKα結(jié)構(gòu)域 EgAMPKα中存在絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶α亞基的催化結(jié)構(gòu)域，位于第17～272氨基酸區(qū)段，EgAMPKα的自抑制區(qū)域位于第289～343氨基酸區(qū)段，在EgAMPKα亞基C-末端發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)β/γ連接的結(jié)構(gòu)域，位于第359～476氨基酸區(qū)段（圖1）。

圖1 EgAMPKα的保守結(jié)構(gòu)域

2.5 EgAMPKα二級(jí)結(jié)構(gòu) EgAMPKα的二級(jí)結(jié)構(gòu)（包括α螺旋，β折疊，β轉(zhuǎn)向和無(wú)規(guī)卷曲）。EgAMPKα基因序列長(zhǎng)度是478，其中α螺旋約占32.85%，β折疊約占17.99%，β轉(zhuǎn)角約占6.90%，無(wú)規(guī)卷曲約占42.26%（圖2）。

2.6 EgAMPKα的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè) EgAMPKα預(yù)測(cè)了7個(gè)具有良好柔韌性、表面可及性和高抗原性指數(shù)的區(qū)域，分別位于55～59、61～67、110～123、135～142、270～282、320～340、420～440氨基酸區(qū)段（圖3）。

圖2 EgAMPKα二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 EgAMPKα的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

2.7 EgAMPKα和HsAMPKα2的同源建模及分子對(duì)接研究Swiss-Model服務(wù)器構(gòu)建的EgAMPKα3D結(jié)構(gòu)與模板序列同源性為41.87%，GMQE值為0.53；HsAMPKα2的3D結(jié)構(gòu)與模板序列同源性為41.88%，GMQE值為0.43。EgAMPKα中86.96%的殘基3D/1D平均值≥0.2，HsAMPKα2中91.36%的殘基3D/1D平均值≥0.2。二甲雙胍與HsAMPKα2的結(jié)合涉及5個(gè)氫鍵，分別與氨基酸殘基ASP-290和GLU-304連接，結(jié)合能為-4.18 kcal/mol。二甲雙胍與EgAMPKα的結(jié)合涉及4個(gè)氫鍵，分別與氨基酸殘基GLUT294和GLU298連接，結(jié)合能為-4.58 kcal/mol（圖4）。

圖4二甲雙胍與HsAMPKα2、EgAMPKα分子對(duì)接

2.8 EgAMPKα及其同源基因的多重序列比對(duì)EgAMPKα的催化結(jié)構(gòu)域在所有被比對(duì)的物種中較為保守，EgAMPKα（GenBanK ID：AER10553.1）與其同源 基 因（GenBank ID：AER10552.1、AZB50365.2、GAA51741.1、AAR06928.1、ABQ62953.1、PKK20873.1、ACL80207.1、NP_001103756.1、AAW79567.1、NP_006 243.2）的相似性分別為99.79%、81.17%、84.09%、66.99%、66.67%、62.64%、62.78%、62.42%、61.32%、63.00%（圖5）。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的AMPKα與多房棘球絳蟲(chóng)的AMPKα具有高度的相似性，而與小鼠和人等哺乳動(dòng)物序列相似性較低。

圖5 EgAMPKα及其同源基因的多重序列比對(duì)

2.9 EgAMPKα系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建EgAMPKα與多房棘球絳蟲(chóng)（GenBank ID：AER10552.1）、肺吸蟲(chóng)（GenBank ID:KAA3677245.1）、曼氏血吸蟲(chóng)（Gen-Bank ID：AZB50365.2）、華支睪吸蟲(chóng)（GenBank ID：GAA51741.1）、日本血吸蟲(chóng)（GenBank ID：TNN11340.1）的共處一個(gè)分支，其中與多房棘球絳蟲(chóng)親緣關(guān)系最近，而與人、小鼠等哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖6 EgAMPKα與其他物種AMPKα的進(jìn)化樹(shù)

3 討論

囊型包蟲(chóng)病極易被忽視，但它卻嚴(yán)重威脅生命的人畜共患病，需要加強(qiáng)防治并研發(fā)新型治療途徑[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞通過(guò)攝取大量的葡萄糖，通過(guò)糖酵解途徑以滿(mǎn)足自身浸潤(rùn)性、無(wú)限制性地增殖[20]。而當(dāng)葡萄糖含量無(wú)法滿(mǎn)足癌細(xì)胞增殖時(shí)，會(huì)通過(guò)磷酸化AMPKα上的Thr172位點(diǎn)活化AMPK，從而增加下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。

本課題組在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體中存在EgAMPKα，因而對(duì)EgAMPKα及其同源基因進(jìn)行了比對(duì)分析。本研究發(fā)現(xiàn)EgAMPKα是一個(gè)較為保守的基因，與人和小鼠的同源性分別為63.00%和61.32%。EgAMPKα的N端存在一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶α亞基的催化結(jié)構(gòu)域，提示該催化結(jié)構(gòu)域與其他物種的α催化結(jié)構(gòu)有著類(lèi)似的功能。本研究發(fā)現(xiàn)在催化結(jié)構(gòu)域的176位點(diǎn)上存在一個(gè)特征性的Thr磷酸化位點(diǎn)，負(fù)責(zé)對(duì)EgAMPKα的活化，這與人類(lèi)AMPKα1的Thr172位點(diǎn)位置不同。但總的來(lái)說(shuō)，EgAMPK與哺乳動(dòng)物具有類(lèi)似的功能結(jié)構(gòu)域，但在親緣關(guān)系和序列相似性上，與多房棘球絳蟲(chóng)的AMPKα具有高度的同源性，而與人和小鼠等哺乳動(dòng)物的AMPKα存在較大差異。提示可以針對(duì)EgAMPKα的基因序列設(shè)計(jì)特異性的藥物分子，靶向寄生蟲(chóng)AMPKα的同時(shí)減少對(duì)宿主AMPK的影響。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，基因與小分子化合物相互作用的預(yù)測(cè)變得尤為重要，評(píng)估小分子與治療靶點(diǎn)結(jié)合的親和力是藥物靶點(diǎn)研究的重要組成部分，極大的簡(jiǎn)化了藥物靶點(diǎn)的篩選過(guò)程[21]。二甲雙胍是一種具有降糖[22]、抗癌[23]和抗寄生蟲(chóng)[24]活性的藥物分子。已有研究報(bào)道，二甲雙胍可以通過(guò)作用于線(xiàn)粒體，提高細(xì)胞AMP濃度或通過(guò)激活A(yù)MPK上游激酶，使AMPKα亞基中的Thr-172發(fā)生磷酸化從而間接激活A(yù)MPK[25]。但二甲雙胍與EgAMPKα之間是否存在直接的相互作用尚不清楚。本研究以人類(lèi)的AMPKα亞基結(jié)構(gòu)作為對(duì)照，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在EgAMPKα和HsAMPKα的自抑制區(qū)域中都存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，且對(duì)EgAMPKα的結(jié)合較HsAMPKα2更為緊密，表明二甲雙胍對(duì)寄生蟲(chóng)的藥效較人類(lèi)宿主可能更為明顯。AMPKα的自抑制區(qū)域位于α催化結(jié)構(gòu)域和C端β/γ結(jié)合結(jié)構(gòu)域中間，呈現(xiàn)出α-螺旋的結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)對(duì)AMPK活性的抑制[26]。已有研究報(bào)道，小分子化合物PT1可以通過(guò)與人類(lèi)AMPKα中的自抑制區(qū)域結(jié)合，從而激活A(yù)MPK[27]。提示二甲雙胍可以通過(guò)與EgAMPKα上的自抑制區(qū)域結(jié)合，干擾自抑制區(qū)域發(fā)揮抑制AMPK活化的功能，從而更有利于EgAMPK上游激酶對(duì)EgAMPK的活化作用。因此本研究認(rèn)為EgAMPKa的自抑制區(qū)域不僅具有抑制AMPK活性的功能，還可作為一個(gè)潛在的包蟲(chóng)藥物靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)分析EgAMPKα的結(jié)構(gòu)與功能，并借助分子對(duì)接技術(shù)分析藥物分子對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)與宿主之間可能存在的靶點(diǎn)效應(yīng)，EgAMPKα有望成為一種新型包蟲(chóng)病藥物候選靶點(diǎn)，為包蟲(chóng)病藥物開(kāi)發(fā)和靶點(diǎn)篩選上提供了一定理論基礎(chǔ)。