黃明慧，張倩茹，韓夢(mèng)琪，高希龍，李 華，羅 星

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東煙臺(tái)264670）

目前，中國(guó)農(nóng)作物秸稈綜合利用率較低［1］，人們對(duì)小麥秸稈大多采取的是焚燒處理方式［2］，不僅易引發(fā)火災(zāi)，而且污染環(huán)境、浪費(fèi)資源。花生是中國(guó)重要的油料作物之一［3］，花生秸稈產(chǎn)量較大，僅山東省就達(dá)489萬(wàn)t。因其營(yíng)養(yǎng)豐富，常被用來(lái)作為牲畜的飼料。風(fēng)干的花生秸稈硬度大，木質(zhì)化程度高，適口性差，飼料化利用率較低［4］?；ㄉt衣為花生深加工后的副產(chǎn)物，可入藥，含豐富的多酚類物質(zhì)，抗氧化活性強(qiáng)，可作為天然抗氧化劑［5］，對(duì)多種出血癥也有較好的治療效果［6］。其含有的原花青素，具有降血壓、降血糖和抗過(guò)敏的作用。中國(guó)花生紅衣產(chǎn)量約18萬(wàn)t/年，除了少量用于制藥外，大部分成為固體廢棄物［7］。

植物源生化富里酸（Biotechnology fulvic acid，BFA），是利用微生物發(fā)酵技術(shù)從植物源中制取的一種生物發(fā)酵產(chǎn)物。這種富里酸含礦物質(zhì)、氨基酸、核酸、內(nèi)源激素［8］等生物活性物質(zhì)，能提高植物體內(nèi)的多種酶活性，促進(jìn)新陳代謝及農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育，是一種良好的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［9］，可提高作物產(chǎn)量及改善品質(zhì)［10］，增強(qiáng)作物抗逆性［11］，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面大有益處。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究得出，在施用相同化肥量的條件下，增施秸稈源富里酸肥料可顯著提高作物產(chǎn)量［12］。富里酸具有較高的比表面積和螯合能力，能與金屬離子、農(nóng)藥和多種有機(jī)物結(jié)合形成螯合物，影響土壤基質(zhì)中有毒物質(zhì)的滯留和釋放狀況［13］。劉厶瑤等［14］采用土壤培養(yǎng)試驗(yàn)研究了富里酸對(duì)土壤中污染水平較高的DNBP降解的動(dòng)力學(xué)過(guò)程，表明適宜濃度的富里酸對(duì)DNBP的降解效果最佳。徐燦燦等［15］研究了富里酸與葉面硒肥同時(shí)作用時(shí)，可對(duì)低汞污染的油菜農(nóng)田土壤有修復(fù)功能。Samavat等［16］研究了腐植酸物質(zhì)對(duì)黃楊枯萎病的影響，表明腐植酸物質(zhì)對(duì)病害有一定的防治效果。

以花生秸稈、小麥秸稈、花生紅衣為原料，采用發(fā)酵法生產(chǎn)富里酸，研究不同原料的富里酸對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。嘗試?yán)棉r(nóng)作物秸稈通過(guò)微生物發(fā)酵制備生化富里酸，探索秸稈高附加值利用的新途徑，期望服務(wù)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：花生秸稈、小麥秸稈采自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院實(shí)驗(yàn)基地；花生紅衣取自山東威海臨港區(qū)秀榮花生專業(yè)合作社；小麥種子（京冬22號(hào)）購(gòu)置于煙臺(tái)市芝罘區(qū)種子公司。

儀器：PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WMK-08恒溫培養(yǎng)箱，山東濰坊醫(yī)療器械廠；HWY-100B恒溫培養(yǎng)搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；HWS12型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)海道爾夫公司。

藥品：重鉻酸鉀、濃硫酸、硫酸亞鐵、鄰菲羅琳、氫氧化鈉、焦磷酸鈉均為分析純，去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 方法

1.2.1 生化富里酸制備小麥秸稈、花生秸稈、花生紅衣干燥后粉碎，過(guò)40目篩，密封4℃貯存。取500 g小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈和混合秸稈（小麥秸稈∶花生秸稈∶花生紅衣=2∶2∶1）放入發(fā)酵桶中，加入20 g紅糖、30 g玉米淀粉、5 g尿素、5 mL菌液，用去離子水調(diào)節(jié)含水率為60%～65%，放入培養(yǎng)箱中35℃發(fā)酵7 d。發(fā)酵后的物料按質(zhì)量比1∶3加去離子水，攪拌均勻，擠壓提取富里酸粗液。富里酸粗液中加入5 mL發(fā)酵菌，25℃曝氣發(fā)酵72 h后，用焦磷酸鈉與氫氧化鈉的混合溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液至pH 8～10，靜置1 h后過(guò)濾得到生化富里酸精制液［17］，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到生化富里酸濃縮液。

1.2.2 富里酸含量測(cè)定采用重鉻酸鉀滴定法，稱取試樣于錐形瓶中，加入適量去離子水，于瓶口插上小玻璃漏斗，置于沸水浴中加熱溶解，期間攪動(dòng)多次。30 min后取出錐形瓶，待冷卻至室溫后，將溶液及殘?jiān)哭D(zhuǎn)入容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，棄去最初的部分濾液。準(zhǔn)確吸取濾液于錐形瓶中，加入5 mL重鉻酸鉀溶液，緩慢加入濃硫酸15 mL，于沸水浴中加熱氧化。30 min后將錐形瓶取出，冷卻至室溫，加入適量去離子水、2～3滴鄰菲羅琳指示劑，用硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液由橙色經(jīng)綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榇u紅色為終點(diǎn)［18］。

按下式計(jì)算出生化富里酸產(chǎn)率。

式中，V0表示滴定空白管所消耗的硫酸亞鐵銨體積；V表示滴定樣品管所消耗的硫酸亞鐵銨體積；N表示硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度；0.003為碳的毫克當(dāng)量；a表示樣品溶液滴定的體積；b表示測(cè)定時(shí)所吸取的樣品溶液的體積；G表示配制樣品溶液時(shí)所加入的樣品干重；C表示富里酸的含碳比（取0.5）。

1.2.3 發(fā)芽趨勢(shì)生化富里酸濃縮液稀釋20、15、12、10倍，去離子水為空白對(duì)照。將小麥種子用去離子水沖洗干凈，放入鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每組放100粒，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。分別向培養(yǎng)皿中加入預(yù)先配制的不同種類、不同稀釋倍數(shù)的富里酸溶液至種子高度的1/3～1/2，帶孔保鮮膜覆蓋，25℃恒溫箱中培養(yǎng)144 h，觀察發(fā)芽情況。胚根長(zhǎng)度大于等于種子長(zhǎng)度，胚芽長(zhǎng)度大于等于種子長(zhǎng)度的50%時(shí)認(rèn)定為發(fā)芽［19］。

式中，Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)；T為種子總數(shù)。

1.2.4 胚根測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿中選取長(zhǎng)勢(shì)均一、健康的小麥幼苗30株，測(cè)其胚根長(zhǎng)度，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵原料對(duì)生化富里酸產(chǎn)率的影響

用小麥秸稈、花生秸稈、花生紅衣、混合秸稈發(fā)酵制備生化富里酸，采用容量法檢測(cè)生化富里酸產(chǎn)率，結(jié)果見表1。由表1可知，發(fā)酵小麥秸稈和混合秸稈均具有較高的生化富里酸產(chǎn)率，其中，混合秸稈產(chǎn)率最高，達(dá)7.44%，較發(fā)酵花生紅衣高2.87個(gè)百分點(diǎn)。表明小麥、花生秸稈的纖維素、半纖維素易降解，花生紅衣降解較慢；但適當(dāng)比例混合后發(fā)酵可充分發(fā)揮三者的協(xié)同作用，從而提高生化富里酸的產(chǎn)率。

表1 原料對(duì)富里酸發(fā)酵制備的影響

2.2 生化富里酸對(duì)發(fā)芽趨勢(shì)的影響

用制備的生化富里酸稀釋液（以花生秸稈源為例）進(jìn)行小麥種子發(fā)芽趨勢(shì)研究，以去離子水為空白對(duì)照。144 h發(fā)芽率變化如圖1所示。24～96 h發(fā)芽程度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，96 h達(dá)最大；96～144 h發(fā)芽率變化不大。相對(duì)于空白對(duì)照，生化富里酸能明顯提高種子的發(fā)芽率，在96 h生化富里酸提升發(fā)芽率15.00個(gè)百分點(diǎn)。表明生化富里酸中含對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的酶類、氨基酸、維生素和微量元素等生物活性物質(zhì)［20］。

2.3 生化富里酸濃度對(duì)發(fā)芽率的影響

取自制生化富里酸溶液（以花生秸稈源為例）（4.92 g/L）分別稀釋10、12、15、20倍，以去離子水為空白對(duì)照進(jìn)行發(fā)芽率研究，結(jié)果如圖2所示。與空白對(duì)照相比，生化富里酸稀釋15、20倍能促進(jìn)種子發(fā)芽，生化富里酸稀釋10、12倍時(shí)抑制種子發(fā)芽，其中，稀釋15倍時(shí)效果最好，能提升種子發(fā)芽率15.00個(gè)百分點(diǎn)。

圖2 生化富里酸濃度對(duì)發(fā)芽率的影響

2.4 不同發(fā)酵原料生產(chǎn)的生化富里酸對(duì)發(fā)芽率的影響

利用小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈和混合秸稈為原料發(fā)酵，制備出4種不同的生化富里酸，在相同稀釋濃度下（稀釋15倍），以去離子水為空白對(duì)照進(jìn)行發(fā)芽率試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。與空白對(duì)照相比，4種生化富里酸均能提高種子發(fā)芽率，但提高程度不同。其中，花生秸稈源生化富里酸效果最好，發(fā)芽率提升23.00個(gè)百分點(diǎn)；花生紅衣、小麥秸稈、混合秸稈源生化富里酸發(fā)芽率分別提升15.00、7.00、10.00個(gè)百分點(diǎn)。表明花生秸稈發(fā)酵產(chǎn)生的生化富里酸具有較高的生物活性。

圖3 不同源生化富里酸溶液對(duì)種子發(fā)芽率的影響

2.5 不同源生化富里酸對(duì)種子胚根長(zhǎng)度的影響

取小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈和混合秸稈為原料生產(chǎn)的生化富里酸稀釋液，處理小麥種子96 h，以去離子水為空白對(duì)照，選取各培養(yǎng)皿中長(zhǎng)勢(shì)均一、健康的幼苗30株，測(cè)其胚根長(zhǎng)度，結(jié)果如表2所示。不同源的生化富里酸稀釋液對(duì)種子胚根長(zhǎng)度的影響趨勢(shì)與其對(duì)發(fā)芽率的影響趨勢(shì)相近，均明顯促進(jìn)種子胚根伸長(zhǎng)?；ㄉ斩捲瓷焕锼嵯♂屢簩?duì)胚根長(zhǎng)度促進(jìn)作用最大，根長(zhǎng)達(dá)39.4 mm，相比CK增加7.1%。小麥秸稈源生化富里酸稀釋液促進(jìn)作用不明顯。

表2 不同源生化富里酸稀釋液對(duì)種子胚根長(zhǎng)度的影響

3 小結(jié)

利用小麥秸稈、花生紅衣、花生秸稈、混合秸稈發(fā)酵制備生化富里酸，研究不同稀釋倍數(shù)的生化富里酸溶液對(duì)小麥種子發(fā)芽率的影響及不同源生化富里酸的生理活性，得出主要結(jié)論如下。

1）不同原料制備生化富里酸的產(chǎn)率不同。混合原料（小麥秸稈∶花生秸稈∶花生紅衣=2∶2∶1）具有較高產(chǎn)率，達(dá)7.44%，小麥秸稈生化富里酸產(chǎn)率為6.79%。

2）不同稀釋倍數(shù)的生化富里酸對(duì)種子萌發(fā)的影響不同。高濃度的生化富里酸溶液對(duì)種子發(fā)芽有抑制作用，低濃度有促進(jìn)作用。其中，生化富里酸溶液（4.92 g/L）稀釋15倍具有較好的生理活性。

3）不同原料源生化富里酸生理活性有一定差異。其中，花生秸稈源生化富里酸溶液生理活性最佳，可明顯提高種子發(fā)芽率及促進(jìn)胚根伸長(zhǎng)，對(duì)植物生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用。