蔣希芝，徐 磊，張 蓓，辛向東，Thomas Attaribo，桂仲爭(zhēng)※

（1. 江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212018；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長(zhǎng)江中下游設(shè)施農(nóng)業(yè)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)設(shè)施與裝備研究所，南京 210014；3. 江蘇銀寶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院有限公司，鹽城 224014）

0 引 言

桑椹為多年生木本植物桑樹(shù)（Morus albaL.）的成熟果穗，又名桑葚子、桑果、桑棗等。桑椹不僅含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素，而且富含多種具有生物活性的化合物，如黃酮、生物堿、多糖等多種生物活性成份[1-2]?；ㄇ嗨厥巧ｉ┲泻控S富的重要活性成分之一，也是天然色素的重要來(lái)源之一[3]。花青素是具有親水性和水溶性的多酚類植物色素及其代謝產(chǎn)物，是重要的抗氧化劑之一[4-5]，具有廣泛的藥理特性，如抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌和抗癌[6-10]，因此，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力[11]。桑椹果實(shí)中花青素主要有4種存在形式，分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷（P3G）、矢車菊素-3-O-蕓香苷（C3R）和天竺葵素-3-O-蕓香苷（P3R）。C3G和C3R是桑椹花青素中的主要成分[12]。

然而，花青素在加工過(guò)程中很不穩(wěn)定，易受多種不同外部條件影響[13-14]。溫度和光照是影響花青素降解穩(wěn)定性的重要因素，顯著降低其穩(wěn)定性和生物活性[15]。Fracassetti等[16]觀察發(fā)現(xiàn)花青素在25和42 ℃下的前14 d降解量緩慢，為3%，而在60和80 ℃下的第3天則降解很快，分別為60%和85%。加熱處理可將花青素或其結(jié)合糖苷分解成小分子，如醛類、苯甲酸衍生物或同義花青素[17]。影響花青素穩(wěn)定性的另一個(gè)重要因素是pH值。Rein等[18]證明，花青素水溶液在不同的pH值下存在4種形式的相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致不同顏色的存在。特別是在弱酸性到中性范圍內(nèi)，穩(wěn)定性大大降低。此外，金屬離子[19]、糖含量[20]和過(guò)氧化氫[21]也會(huì)影響花青素的穩(wěn)定性。因此，花青素相對(duì)較低的穩(wěn)定性是限制其廣泛有效應(yīng)用的關(guān)鍵缺陷和主要障礙[22-24]，盡可能減少花青素的降解，提高其穩(wěn)定性尤為重要。

為了提高花青素的穩(wěn)定性，已報(bào)道的修飾方法有糖基?；痆25]、糖基化[26]、微膠囊化[27]、金屬螯合[28]、脂質(zhì)體[29]和納米粒子載覆[30-31]。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度分析，普通的化學(xué)修飾定向性差，而生物酶法反應(yīng)過(guò)程不會(huì)對(duì)花青素分子造成破壞，具有更高的安全性，更符合農(nóng)業(yè)食品安全要求，而且生物酶具有高度選擇性和專有性。因此，生物酶法更適合對(duì)花青素分子進(jìn)行酰基化修飾[32]。目前，有關(guān)生物酶法對(duì)桑椹花青素酰基化修飾鮮有報(bào)道。

因此，本研究選取成熟桑椹果實(shí)，提取純化制得桑椹花青素。采用生物酶法，對(duì)制備的桑椹花青素進(jìn)行?；磻?yīng)，并與非?；幕ㄇ嗨剡M(jìn)行對(duì)比分析，考察脂肪酶、反應(yīng)溶劑、酰基供體對(duì)花青素?；D(zhuǎn)化率的影響，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。此外，進(jìn)一步分別研究溫度、光照、pH值等條件對(duì)?；ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)和性能的影響，測(cè)定?；ㄇ嗨氐目寡趸钚裕ㄇ宄鼶PPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基能力、總還原能力、Fe2+鰲合能力等，并與合成前花青素進(jìn)行比較，探討?；瘜?duì)花青素穩(wěn)定性和抗氧化活性的影響，從而為花青素在功能性食品、生物醫(yī)藥和植物源農(nóng)藥、日用化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供參考的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

供試桑椹，采自江蘇省鎮(zhèn)江市江心洲中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國(guó)家桑資源圃基地。所摘桑椹為成熟度相近，形狀大小均一，無(wú)霉?fàn)€變質(zhì)，無(wú)病蟲(chóng)害的新鮮桑椹。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C21H21ClO11）標(biāo)準(zhǔn)品由上海麥克林生化科技有限公司提供；甲醇、乙腈，均為色譜純，購(gòu)于德國(guó)默克公司；南極假絲酵母脂肪酶、Amano脂肪酶PS購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；米曲霉脂肪酶購(gòu)于美國(guó)Aladdin公司；豬胰腺脂肪酶、大孔吸附樹(shù)脂（D101）、無(wú)水乙醇、吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮、苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒(méi)食子酸甲酯、4A分子篩、氯化鉀、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鹽酸購(gòu)于上海中試化工總公司，以上試劑均為分析純；DPPH購(gòu)于日本TCI公司，三氯乙酸、菲洛嗪購(gòu)于上海生工，氯化亞鐵購(gòu)于沃凱，以上試劑均為生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-3200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Nicolet iS50傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermo；HPLC 1260Ⅱ高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent；LC 1260 MS G6420A高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析儀，美國(guó)Agilent；QTRAP 6500質(zhì)譜分析儀，美國(guó)SCIEX。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生物酶催化合成酰基化花青素

采用生物酶法對(duì)制備的桑椹花青素進(jìn)行?；磻?yīng)。

選取南極假絲酵母脂肪酶（5 000 U/g）、Amano脂肪酶PS（Pseudomonas，30 000 U/g）、米曲霉脂肪酶（300 000 U/g）、豬胰腺脂肪酶（500 U/g）作為輔助花青素?；拇呋?，反應(yīng)體積共10 mL，花青素20 mg、苯甲酸甲酯0.5 mol/L，分別加入酶活力1 000 U的不同的脂肪酶，吡啶2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

選取吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮作為酶催化酰基化反應(yīng)溶劑，反應(yīng)體積共10 mL，花青素20 mg，苯甲酸甲酯0.5 mol/L，酶活力1 000 U南極假絲酵母脂肪酶，分別加入吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

選取苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒(méi)食子酸甲酯作為酰基供體，反應(yīng)體積共10 mL，花青素20 mg，加入苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒(méi)食子酸甲酯各0.5 mol/L，酶活力1 000 U南極假絲酵母脂肪酶，吡啶2 mol/L，干燥活化4A分子篩1 g，40 ℃恒溫振蕩反應(yīng)12 h。

1.3.2 高效液相色譜分析花青素含量

樣品在去離子水中稀釋后，進(jìn)入配有四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和DAD檢測(cè)器的高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。在20 ℃下，使用反相色譜柱（Poroshell 120 EC-C18，4.0μm，4.6 mm×150 mm）測(cè)定花青素的含量。設(shè)置流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量2.0μL。流動(dòng)相為1%甲酸水溶液（A）和1%甲酸乙腈溶液（B）。試驗(yàn)在以下條件下進(jìn)行：0～2.50 min，線性梯度從8%到12%B；2.50～5.00 min，線性梯度從12%到18%B；5.00～10.10 min，線性梯度從18%到20%B；10.10～12.00 min，線性梯度從20%到80%B；12.00～14.00 min，80%B；14.00～14.10 min，線性梯度從80%到8%B；14.10～18.00 min，8%B；最后，在下一次注射之前清洗并重新平衡色譜柱。分析期間，所有樣品均保持在4 ℃，于520 nm處檢測(cè)花青素。

1.3.3 花青素轉(zhuǎn)化率和保留率測(cè)定

花青素?；D(zhuǎn)化率：采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定花青素?；磻?yīng)后的出峰面積，根據(jù)公式（1）計(jì)算轉(zhuǎn)化率[32]：

式中C為花青素?；D(zhuǎn)化率；S1為反應(yīng)后液相色譜中C3G的出峰面積；S2為反應(yīng)后新生成的C3G?；a(chǎn)物的出峰面積。

花青素保留率：采用高效液相色譜（HPLC）分別測(cè)定花青素?；昂蟮某龇迕娣e，根據(jù)公式（2）計(jì)算保留率[32]：

式中P為花青素酰基化保留率；S0為反應(yīng)前液相色譜中C3G的出峰面積。

1.3.4 ?；ㄇ嗨氐慕Y(jié)構(gòu)分析

利用傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier Transformation Infrared Spectra，F(xiàn)TIR）和紫外-可見(jiàn)光風(fēng)光光度計(jì)進(jìn)行?；Y(jié)構(gòu)的初步分析。在衰減全反射模式（Attenuated Total Reflection mode，ATR）下，用Nicolet-iS50紅外光譜儀對(duì)復(fù)合前后樣品的特征吸收峰進(jìn)行了表征。其中，波數(shù)范圍為525～4 000 cm-1，溫度為25 ℃。

借助紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Ultraviolet-Visible Spectrophotometer，UV-Vis）對(duì)花青素溶液進(jìn)行漫反射光譜測(cè)定，波長(zhǎng)范圍200～600 nm，掃描速度中等，狹縫寬度20 nm，采樣間隔2.0 nm。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

熱穩(wěn)定性：用去離子水將?；臀歹；幕ㄇ嗨叵♂尩较嗤瑵舛?，pH值調(diào)為5。在室溫下平衡1 h后，取相同體積溶液避光密封于離心管中，分別在40、50、60 ℃的溫度下，避光水浴熱處理12 h，研究溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響。采用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，在520 nm處測(cè)定花青素含量。根據(jù)公式（3）計(jì)算花青素保留率[33]：

式中R為花青素保留率；A0為加熱開(kāi)始時(shí)的吸光度（t=0）；At為時(shí)間t時(shí)的吸光度。

光穩(wěn)定性：用去離子水將?；臀歹；幕ㄇ嗨叵♂尩较嗤瑵舛?，pH值調(diào)為5。在室溫下平衡1 h后，取相同體積溶液置于離心管中，在450 W熒光燈照射箱中光照處理12 d，溫度20 ℃，每2 d取樣測(cè)試花青素含量變化，計(jì)算花青素保留率，考察不同光照對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響[33]。

pH穩(wěn)定性：選取pH值范圍2至9，每100 mL緩沖溶液中溶解15 mg花青素。緩沖劑：0.1 mol/L氯化鉀溶液作為pH值為 2的緩沖液；0.1 mol/L檸檬酸溶液作為pH 值為3和4的緩沖液；0.1 mol/L磷酸鹽溶液作為pH值為 5、6和7的緩沖液；0.1 mol/L磷酸鹽-氫氧化鈉溶液作為pH值為 8和9的緩沖液。計(jì)算花青素含量變化，分析pH值對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.6 抗氧化性試驗(yàn)

DPPH自由基清除能力：稱取一定量的DPPH，用無(wú)水乙醇配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液。分別取0.2 mL不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液，加入0.4 mL DPPH溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測(cè)吸光值。用VC作為陽(yáng)性對(duì)照。樣品對(duì)DPPH自由基的清除率利用公式（4）計(jì)算[34]：

式中Ad0為0.2 mL無(wú)水乙醇+0.4 mLDPPH溶液的吸光值；Ad1為0.2 mL樣品溶液+0.4 mLDPPH溶液的吸光值；Ad2為0.2 mL樣品溶液+0.4 mL無(wú)水乙醇的吸光值。

總還原能力：在離心管中分別加入0.2 mol/L pH值為6.6的磷酸緩沖液0.25mL和不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液0.2 mL，加入0.25 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后于50 ℃反應(yīng)20 min。取出后加入0.25 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000 r/min離心10 min。取上清液加入0.2 mL蒸餾水和0.05 mL 0.1%FeCl3，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測(cè)吸光值。VC作為陽(yáng)性對(duì)照[34]。

Fe2+鰲合能力：分別取0.4 mL不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）的溶液，加入2 mmol/L的FeCl2溶液0.1 mL和5 mmol/L的菲洛嗪溶液0.2 mL，25 ℃水浴10 min，于562 nm處測(cè)吸光值，EDTA為陽(yáng)性對(duì)照。樣品對(duì)Fe2+鰲合率利用公式（5）計(jì)算[34]：

式中Af0為0.4 mL蒸餾水+0.1 mLFeCl2+0.2 mL菲洛嗪吸光值；Af1為0.4 mL樣品+0.1 mL FeCl2+0.2 mL菲洛嗪吸光值；Af2為0.4 mL樣品+0.1 mL蒸餾水+0.2 mL菲洛嗪吸光值。

1.3.7 MTT（Thiazolyl blue tetrazolium bromide）噻唑藍(lán)試驗(yàn)

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢上皮細(xì)胞CHO-k1活性檢測(cè)，培養(yǎng)基：Ham’s F-12K+10%FBS（Fetal Bovine Serum）。1）收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，每孔加100μL（待測(cè)細(xì)胞密度8 000個(gè)/孔）；2）5%CO2、37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿孔底，棄培養(yǎng)基，加入不同濃度梯度的待測(cè)樣品（一般下午鋪板，次日上午加藥）；樣品用純F-12K培養(yǎng)基（無(wú)FBS）進(jìn)行梯度稀釋后，以樣品∶培養(yǎng)基=1∶9的比例加入96孔板（一般先加20μL樣品，再加180μL培養(yǎng)基）；以PBS作陰性對(duì)照；3）繼續(xù)培養(yǎng)16～48 h后，加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h（注意避光）；4）終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)基；注意不要將結(jié)晶物吸出；5）每孔加入150μL DMSO（Dimethyl Sulfoxide），置搖床低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，測(cè)A490 nm；6）細(xì)胞活性%=樣品吸光值/對(duì)照組吸光值×100，抑制率計(jì)算公式如（6）所示：

式中N為抑制率；An0為對(duì)照組吸光值；An1為樣品吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物酶催化條件對(duì)花青素?；挠绊?/h3>

生物酶催化活性是影響桑椹花青素酰基化的重要因素之一，本文選取了4種脂肪酶（1-南極假絲酵母脂肪酶、2-Amano脂肪酶PS、3-米曲霉脂肪酶、4-豬胰腺脂肪酶），在相同酶活條件下，對(duì)花青素?；D(zhuǎn)化率和保留率進(jìn)行測(cè)定分析，如圖1所示，4種脂肪酶的轉(zhuǎn)化率在10%～15%之間，其中，南極假絲酵母脂肪酶催化效果最好，酰基轉(zhuǎn)化率為13.5%，花青素保留率最高，為38.4%。其余3種脂肪酶的催化效果較為接近。

酶催化反應(yīng)溶劑對(duì)桑椹花青素酰基化效果具有顯著的影響，本文選取了4種反應(yīng)溶劑（吡啶、叔丁醇、叔戊醇、丙酮），圖2所示為不同反應(yīng)溶劑對(duì)花青素?；D(zhuǎn)化率和保留率的影響。在不同反應(yīng)溶劑作用下，花青素?；D(zhuǎn)化率差異明顯。當(dāng)吡啶作為反應(yīng)溶劑時(shí)，花青素?；D(zhuǎn)化率最高，為13.5%，而叔丁醇、叔戊醇、丙酮的?；D(zhuǎn)化率均低于4%，但是花青素保留率均較高，保持在50%～65%之間，這是因?yàn)橐允宥〈肌⑹逦齑?、丙酮作為反?yīng)溶劑時(shí)，?；实停芤褐蟹酋；幕ㄇ嗨剌^多，導(dǎo)致保留率較高。

不同的?；w對(duì)酰基化花青素的結(jié)構(gòu)和性能影響較大，本文選取苯甲酸甲酯、水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒(méi)食子酸甲酯作為?；w，如圖3所示，研究了不同的酰基供體對(duì)花青素?；D(zhuǎn)化率和保留率的影響。由圖可得，當(dāng)苯甲酸甲酯作為?；w時(shí)，花青素酰基轉(zhuǎn)化率最高為13.5%，水楊酸甲酯的酰基轉(zhuǎn)化率最低為8.8%。苯甲酸甲酯的花青素保留率也最高為38.4%，水楊酸甲酯、肉桂酸甲酯、沒(méi)食子酸甲酯的保留率均低于30%。

花青素的?；磻?yīng)是將其羥基與脂肪酸以及其他物質(zhì)酯化，以增強(qiáng)穩(wěn)定性和親脂性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，以轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，最佳組合為南極假絲酵母脂肪酶、吡啶、苯甲酸甲酯。南極假絲酵母脂肪酶催化花青素-3-O-葡萄糖苷，這種酶促反應(yīng)可以在富含花青素的提取物上進(jìn)行，也可以根據(jù)修飾的物理性質(zhì)進(jìn)行分離，是?；囼?yàn)效果較為理想的催化酶[35]。在酶催化反應(yīng)溶劑體系中，有機(jī)溶劑性質(zhì)會(huì)影響酶的活性、選擇性、穩(wěn)定性以及反應(yīng)效果。由于花青素水溶性較高，親脂性極低，需采用極性較強(qiáng)有機(jī)溶劑使其在反應(yīng)中溶解。然而，有研究表明，溶劑極性過(guò)高易降低脂肪酶分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和酶催化活性[32]。因此，選用吡啶作為反應(yīng)中使用的極性有機(jī)溶劑，既能較好的溶解桑椹花青素，又能保持酶催化活性。對(duì)復(fù)雜的桑椹提取物進(jìn)行提取和純化，再以提純的桑椹花青素為基體，通過(guò)酶法酰基化，以轉(zhuǎn)化率為考核指標(biāo)時(shí)，苯甲酸甲酯對(duì)花青素的?；D(zhuǎn)化效率最高，這可能和花青素的多種結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.2 ?；ㄇ嗨亟Y(jié)構(gòu)分析

采用傅里葉紅外光譜儀在525至4 000 cm-1的吸收光譜范圍內(nèi)對(duì)非酰基化花青素和?；ㄇ嗨剡M(jìn)行基團(tuán)分析，如圖4a所示，非酰基化花青素在3 262～3 325 cm-1處為酚羥基上-OH寬而強(qiáng)的伸縮吸收峰，2 981 cm-1處為糖環(huán)亞甲基上C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 638 cm-1為苯環(huán)的特征吸收峰，1 043 cm-1為C-O伸縮振動(dòng)相對(duì)應(yīng)。與非?；ㄇ嗨叵啾容^，?；ㄇ嗨卦? 262～3 325 cm-1處-OH吸收峰減弱，2 974 cm-1處的C-H峰增強(qiáng)，1 650～1 870 cm-1處為C=O吸收峰，1 000～1 300 cm-1處為酚類分子的-OH彎曲振動(dòng)吸收與C-O-C伸縮振動(dòng)吸收等多種成分組成，并且兼具有苯環(huán)（1 420～1 600 cm-1）的骨架振動(dòng)峰，峰明顯增強(qiáng)趨于穩(wěn)定。

采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)200～600 nm范圍內(nèi)的非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨剡M(jìn)行了掃描。圖4b所示為酰基化對(duì)花青素吸光度的影響。對(duì)花青素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，非?；ㄇ嗨貥悠吩?80 nm處有明顯的吸收，且在該波長(zhǎng)處的吸收最為穩(wěn)定，說(shuō)明含有苯環(huán)，并且苯環(huán)上帶有酚羥基。361 nm處有吸收峰，300～400 nm處，主要是由B環(huán)上的酰基化基團(tuán)引發(fā)的。?；ㄇ嗨氐奈辗逵?80 nm前移到271 nm，說(shuō)明花青素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。240～280 nm（271 nm）主要是由A環(huán)上的苯甲?；鶊F(tuán)引發(fā)的，227 nm的吸收峰主要是B環(huán)的六元不飽和環(huán)酮引起的，此時(shí)B環(huán)上不存在?；?/p>

2.3 ?；瘜?duì)花青素穩(wěn)定性影響

圖5a所示為非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨卦诓煌瑴囟认卤芄馑?2 h后的熱穩(wěn)定性。40、50和60 ℃下，酰基化花青素的保留率分別為89.1%、87.4%和84.2%，非?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈史謩e為84.5%、82.3%和79.0%，相同溫度下，酰基化花青素的保留率比非?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈示呒s5.0%。這表明，在一定溫度作用下，?；ㄇ嗨乇确酋；ㄇ嗨叵鄬?duì)穩(wěn)定，桑椹花青素經(jīng)酰基化處理后，可以在這些溫度下可以很好地保存。在一定溫度作用下，花青素及其糖苷被分解成小分子，如醛類、苯甲酸衍生物或同義花青素[17]，且隨著溫度的增加，降解越顯著，但酰基化花青素的熱穩(wěn)定性優(yōu)于非?；ㄇ嗨?。

與溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性的影響相比，光照顯著影響花青素的穩(wěn)定性。圖5b所示，在20 ℃下暴露于450 W光照2、4、6、8、10和12 d后，非酰基化花青素保留率在10 d內(nèi)線性急劇下降到77.3%，第12天保留率為68.0%。然而，?；ㄇ嗨乇Ａ袈适冀K高于非?；ㄇ嗨?，前6 d內(nèi)，保留率下降緩慢，第6天保留率仍高達(dá)96.1%；后6 d保留率下降稍有增加，第12天保留率為74.3%。有研究表明?；蚧ㄇ嗨靥峁╇娮拥臐撛谀芰36]，在增強(qiáng)了?；ㄇ嗨氐墓庹辗€(wěn)定性。

pH值對(duì)酰基化花青素穩(wěn)定性的影響如圖5c所示。由圖可得，花青素對(duì)pH值敏感，花青素濃度隨pH值變化顯著。在低pH值酸性條件下，pH值為2時(shí)，非?；ㄇ酀舛茸兓茸畲?，接近?；ㄇ嗨氐?倍；pH值為3時(shí)，酰基化花青素的濃度幾乎不發(fā)生變化，而非?；ㄇ酀舛仍黾?0%。在pH值為4～6時(shí)，?；ㄇ嗨嘏c非酰基化花青素的濃度基本無(wú)變化。在堿性pH值為7～9時(shí)，酰基化花青素與非?；ㄇ嗨氐臐舛染l(fā)生變化，pH值為8時(shí)，非?；ㄇ酀舛仍黾蛹s80%，為?；ㄇ嗨氐?倍。通過(guò)以上分析可得，?；ㄇ嗨卦诓煌琾H值下更加穩(wěn)定，尤其是在強(qiáng)酸性和強(qiáng)堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性大大提高?；ㄇ嗨氐男阅芤资苋芤簆H值變化影響，這與其分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在低pH值區(qū)（pH值＜3），花青素以高度穩(wěn)定的黃色離子存在，呈鮮紅色。隨著pH值的升高，水解產(chǎn)物變成無(wú)色的甲醇假堿，經(jīng)開(kāi)環(huán)形成黃色的查爾酮，而酰基化花青素更穩(wěn)定。多?；ㄇ嗨氐母叻€(wěn)定性是由于其與芳香羧酸之間的疏水作用形成的三明治狀分子內(nèi)堆積，阻止了糖苷的水合作用和顏色的降解[25]。

2.4 ?；瘜?duì)花青素抗氧化性影響

?；瘜?duì)花青素DPPH自由基清除能力的影響如圖6a所示，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。研究發(fā)現(xiàn)，兩組DPPH自由基清除活性表現(xiàn)顯著差異，?；ㄇ嗨谼PPH自由基清除能力始終高于非?；ㄇ嗨?。隨著濃度的增加，非酰基化花青素DPPH自由基清除率線性增加，非?；ㄇ嗨谼PPH自由基清除50%時(shí)的濃度IC50值為0.5 mg/mL，當(dāng)花青素濃度為0.8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為71%。而?；ㄇ嗨卦跐舛?.2～0.8 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率范圍為88%～96%，始終穩(wěn)定保持在較高水平。對(duì)?；ㄇ嗨谼PPH自由基清除率進(jìn)行非線性擬合，?；ㄇ嗨豂C50值為0.01 mg/mL。IC50值越大，則DPPH自由基清除50%時(shí)，所需花青素的濃度越大，樣品的抗氧化活性越低。酰基化花青素IC50值顯著小于非?；ㄇ嗨兀虼薉PPH自由基清除能力越強(qiáng)，表明?；岣吡嘶ㄇ嗨氐目寡趸阅堋?/p>

花青素生物抗氧化性與其還原能力密切相關(guān)，在700 nm處吸光度值的大小表示花青素給電子的能力。?；瘜?duì)花青素總還原能力的影響如圖6b所示，以VC作為陽(yáng)性對(duì)照。由圖可得，隨著濃度的增加，非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨氐目傔€原能力均增強(qiáng)，酰基化花青素的總還原能力較非?；幕ㄇ嗨赜兴嵘?。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～0.4 mg/mL時(shí)，非酰基化花青素的吸光度值增加明顯，由0.45增大到了0.73，增加62%；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4～0.8 mg/mL時(shí)，非?；ㄇ嗨氐奈舛戎祷颈３旨s0.75，表明花青素的總還原能力趨于穩(wěn)定。而?；ㄇ嗨氐奈舛戎党示€性增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，酰基化花青素的吸光度值為0.99，這表明其總還原能力比非酰基化花青素提高30%。

花青素具有一定的金屬離子螯合能力，圖6c所示為?；瘜?duì)花青素Fe2+鰲合能力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加，非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨氐腇e2+鰲合能力均呈線性增強(qiáng)趨勢(shì)，酰基化花青素的Fe2+鰲合能力顯著高于非?；ㄇ嗨亍．?dāng)質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，酰化花青素的金屬離子螯合能力已達(dá)到70%。當(dāng)花青素質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，酰化花青素的金屬離子螯合能力高達(dá)到90%，而非?；ㄇ嗨貎H為68%。結(jié)果表明，?；ㄇ嗨氐腇e2+鰲合能力大大提高。

本試驗(yàn)研究采用MTT法測(cè)定非?；ㄇ嗨睾王；ㄇ嗨貙?duì)倉(cāng)鼠卵巢上皮細(xì)胞活性的影響，如圖7所示。結(jié)果表明，非?；王；ㄇ嗨貙?duì)腫瘤細(xì)胞活性均有抑制作用，且隨著花青素濃度逐漸增加，增殖抑制率增大。當(dāng)花青素質(zhì)量濃度范圍6～46μg/mL時(shí)，非?；ㄇ嗨氐募?xì)胞活性抑制率顯著高于酰基化花青素。而當(dāng)花青素質(zhì)量濃度范圍96～750μg/mL時(shí)，?；ㄇ嗨氐募?xì)胞活性抑制率逐漸超過(guò)非酰基化花青素，且隨著濃度的繼續(xù)增大，?；ㄇ嗨貙?duì)細(xì)胞增殖抑制作用越來(lái)越顯著，質(zhì)量濃度為750μg/mL時(shí)，酰基化花青素腫瘤細(xì)胞活性抑制率高達(dá)81%，而非酰基化花青素約為50%。

研究表明，生物酶酰基化花青素可以在不影響生物活性和色度特性的前提下提高其穩(wěn)定性[35]。酰基的類型、位置和數(shù)量是影響穩(wěn)定性的主要因素，通過(guò)增加花青素的極性、分子大小以及改變空間結(jié)構(gòu)來(lái)影響花青素的反應(yīng)性。酰基化降低了花青素的極性，并產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，降低花青素對(duì)親核攻擊的敏感性。由酰基引起的分子間輔色作用對(duì)花青素C2、C4位置的OH親核攻擊產(chǎn)生有效的物理阻礙[25]。此外，生物酶酰基化反應(yīng)具有更強(qiáng)的化學(xué)選擇性和區(qū)域選擇性，不僅能提高黃酮類化合物在各種非水介質(zhì)中的溶解度，而且還能增強(qiáng)其穩(wěn)定性和抗氧化活性[37]。更親脂的衍生物有利于提高花青素的抗氧化能力，可以更有效地保護(hù)親脂底物免受氧化。

3 結(jié) 論

天然花青素可以作為一種優(yōu)良的抗氧化劑，但是在其加工貯藏應(yīng)用過(guò)程中存在著穩(wěn)定性差，脂溶性低的問(wèn)題，本文利用生物酶法?；揎椛ｉ┗ㄇ嗨兀@著改善其穩(wěn)定性和抗氧化性，得到以下結(jié)論：

1）由單因素試驗(yàn)可得，以轉(zhuǎn)化率為考察指標(biāo)，確定反應(yīng)優(yōu)化條件為南極假絲酵母脂肪酶作為催化酶，吡啶作為反應(yīng)溶劑，苯甲酸甲酯作為酰基供體，桑椹花青素?；D(zhuǎn)化率最高為13.5%，保留率最高為38.4%。經(jīng)HPLC-MS正離子模式鑒定分析，花青素酰基化產(chǎn)物可能是單?；ㄇ嗨匾部赡苁嵌圊；ㄇ嗨?。

2）?；揎椏梢源蟠筇岣呋ㄇ嗨氐臒岱€(wěn)定性、光穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。在40、50和60 ℃下可以更好地保存，光照6 d后，?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈嗜愿哌_(dá)96.1%，pH值分別為2、3、8環(huán)境中，?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性顯著提高。

3）?；梢燥@著增加花青素體外抗氧化性，?；ㄇ嗨谼PPH自由基清除能力較強(qiáng)，總還原能力比非酰基化花青素提高30%，金屬離子螯合能力高達(dá)到90%，腫瘤細(xì)胞活性抑制率高達(dá)81%，有效抑制細(xì)胞增殖。

綜上，該研究為花青素在功能性食品、生物醫(yī)藥和植物源農(nóng)藥、日用化妝品等生產(chǎn)領(lǐng)域中的穩(wěn)定應(yīng)用及性能改善提供參考的理論依據(jù)和技術(shù)支持。