劉紅仙，段麗芬，劉曉梅，王惠萍，王曉輝，褚嘉祐，孫 浩，楊昭慶△

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650118；2.云南省昆明市兒童醫(yī)院，云南昆明 650228

腓骨肌萎縮綜合征(CMT)是一類外周神經(jīng)退行性遺傳病，具有顯著的臨床表型和遺傳異質(zhì)性[1]。CMT在普通人群中的患病率約為1/3 300[2]。CMT一般最早的癥狀是由足部肌肉萎縮引起，常導(dǎo)致足部畸形，例如高足弓、平足或卷曲腳趾，下肢腿部難以彎曲。CMT有明顯的臨床異質(zhì)性，常難以明確認(rèn)知和診斷。CMT通常在青春期或成年早期表現(xiàn)出明顯癥狀，但是發(fā)病時(shí)間可能是兒童早期到成年后的任何時(shí)候。即使是同一家庭的成員，CMT癥狀的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡也有所不同。基于對(duì)CMT發(fā)生發(fā)展的認(rèn)知及臨床診治的現(xiàn)狀，本研究擬利用全外顯子組測(cè)序(WES)對(duì)1個(gè)疑似CMT核心家系的致病突變進(jìn)行鑒定和遺傳學(xué)分析，旨在探討引起突變的原因，進(jìn)而證實(shí)該突變的致病性，為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 1個(gè)核心家系來(lái)自云南省，包括先證者及其父親、母親和妹妹。先證者，男，10歲，表現(xiàn)出足部畸形，發(fā)病于3歲左右；先證者父親未見(jiàn)四肢肌張力及功能等表型異常；先證者母親自述8～9歲逐漸出現(xiàn)行走姿勢(shì)異常及四肢肌肉萎縮，后出現(xiàn)下肢癱瘓，現(xiàn)僅能獨(dú)坐，不能站立和行走，四肢纖細(xì)、消瘦，肌容積明顯減少；先證者妹妹病史與先證者類似。該家系中的3例患者因四肢功能表現(xiàn)異常入院治療，疑似肌張力障礙，但是具體原因仍需進(jìn)一步檢查和確診。

1.2方法

1.2.1外周血全基因組DNA的提取 根據(jù)知情同意原則，獲取該核心家系中所有成員的抗凝外周靜脈血5 mL，采用AxyPrepTMBlood genomic DNA Miniprep Kit試劑盒(購(gòu)自江蘇康寧生命科學(xué)有限公司)提取基因組DNA。

1.2.2WES檢測(cè) 采用IIlumina NovaSeq高通量雙端(Pair-end 150bp)測(cè)序平臺(tái)(購(gòu)自北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司)對(duì)先證者基因組DNA全外顯子組進(jìn)行WES檢測(cè)，其簡(jiǎn)要流程如下：將1 μg基因組DNA隨機(jī)打斷成150～200 bp的片段，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增進(jìn)行標(biāo)本標(biāo)記和富集DNA，將構(gòu)建好的文庫(kù)與已標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行液相雜交，利用標(biāo)記磁珠捕獲目標(biāo)區(qū)域，構(gòu)建小片段測(cè)序文庫(kù)。測(cè)序檢測(cè)完成后，經(jīng)堿基識(shí)別轉(zhuǎn)化為原始序列數(shù)據(jù)，通過(guò)變異位點(diǎn)檢索系統(tǒng)和變異位點(diǎn)注釋系統(tǒng)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)及單核苷酸多態(tài)性、插入和缺失檢測(cè)及注釋。以2015年美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)發(fā)布的遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南及2016年發(fā)布的二級(jí)發(fā)現(xiàn)報(bào)告指南SFv2.0為指導(dǎo)[3]，參考單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)和人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選致病突變位點(diǎn)。根據(jù)SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster軟件對(duì)其突變位點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分并預(yù)測(cè)其致病性。SIFT分值為該變異對(duì)蛋白質(zhì)的影響，分值越小越有害；Polyphen-2分值為Human Div數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該變異對(duì)蛋白序列影響的分值，適用復(fù)雜表型中罕見(jiàn)等位基因位點(diǎn)突變的診斷，分值越大越有害，表明該單核苷酸多態(tài)性導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性越大；Mutation Taster分值為Mutation Taster軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果，分值越大結(jié)果越可靠。

1.2.3線粒體融合蛋白2(MFN2)位點(diǎn)Sanger測(cè)序驗(yàn)證 用PCR-Sanger測(cè)序?qū)υ摵诵募蚁?例患者進(jìn)行突變位點(diǎn)的檢測(cè)。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心上在線合成1對(duì)包含MFN2基因(NM_014874.3)c.1090C>T p.R364W突變位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增引物，其中，正向引物序列為5′-TCC CTG GCA GTG AAA ACC AG-3′，反向引物序列為5′-CAG GGA AAG GGC TCT GGA TG-3′。40 μL的反應(yīng)體系為40 ng基因組DNA約10 μL，10 μmol正反向引物各1 μL，2×PCR Master Mix 20 μL，用去離子水補(bǔ)足至40 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 45 s；55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠鑒定后進(jìn)行Sanger測(cè)序。采用Geneious 11.1.5生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)和分析。

2 結(jié) 果

2.1臨床表型 檢測(cè)結(jié)果顯示先證者四肢肌張力升高，雙上肢肌力Ⅳ～Ⅴ級(jí)，雙下肢肌力Ⅳ級(jí)，姿勢(shì)異常：前臂內(nèi)旋，馬蹄內(nèi)翻足，踝關(guān)節(jié)趾曲、翻轉(zhuǎn)，足趾屈曲，步態(tài)蹣跚不穩(wěn)，下肢無(wú)力，手指關(guān)節(jié)攣縮無(wú)法伸直。四肢多條受檢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)傳導(dǎo)功能異常，表現(xiàn)為：(1)雙側(cè)脛、腓總、正中、尺神經(jīng)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(CMAP)均未引出；雙側(cè)股、橈神經(jīng)CMAP波幅降低；(2)各受檢神經(jīng)F波均未引出；(3)各受檢神經(jīng)感覺(jué)神經(jīng)動(dòng)作電位均未引出。神經(jīng)傳導(dǎo)檢測(cè)結(jié)果提示有四肢廣泛性周圍神經(jīng)病變，傳導(dǎo)阻滯，軸索病變?yōu)橹骺赡埽h(yuǎn)端重于近端。

2.2WES結(jié)果 本研究利用WES技術(shù)對(duì)先證者進(jìn)行檢測(cè)并分析其結(jié)果，根據(jù)ACMG指南，在人類外顯子數(shù)據(jù)庫(kù)東亞人群(ExAC_EAS)中未發(fā)現(xiàn)MFN2基因c.1090C>T突變；經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)領(lǐng)域?qū)剐杂?xùn)練等對(duì)其進(jìn)行保守性預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該位點(diǎn)進(jìn)化上保守，具有潛在的功能影響；該位點(diǎn)致病性預(yù)測(cè)皆顯示有害。提示先證者M(jìn)FN2基因c.1090C>T為1個(gè)疑似致病的突變位點(diǎn)。 見(jiàn)表1。

表1 MFN2基因c.1090C>T p.R364W突變位點(diǎn)致病性預(yù)測(cè)

2.3Sanger測(cè)序結(jié)果 PCR-Sanger測(cè)序結(jié)果顯示先證者、母親及妹妹均為MFN2基因單堿基雜合突變c.1090C>T p.R364W，其父親在該位點(diǎn)為野生型，未見(jiàn)堿基突變，表明WES預(yù)測(cè)正確，見(jiàn)圖1。

注：A為CMT患者家系圖譜，一共4名成員，包括3例患者，Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅱ1、Ⅱ2分別為父親、母親、先證者妹妹及先證者(箭頭指示為先證者)；Arg/Trp為精氨酸到色氨酸的氨基酸改變；B為MFN2基因PCR-Sanger測(cè)序結(jié)果。

3 討 論

CMT是一類周圍神經(jīng)遺傳性感覺(jué)損傷和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷的疾病。周圍神經(jīng)可以將大腦和脊髓連接到肌肉和末端感覺(jué)細(xì)胞，這些細(xì)胞可以感知觸摸、疼痛、熱量和聲音等。周圍神經(jīng)軸突的異常會(huì)引起肌張力異常，腓骨進(jìn)行性肌肉萎縮足部畸形，遠(yuǎn)端無(wú)力，感覺(jué)喪失和視神經(jīng)萎縮等[4]。隨著疾病的發(fā)展，患者小腿的肌肉通常會(huì)萎縮，到晚期可能需要使用輪椅。CMT患者通常對(duì)足和小腿的觸摸、疼痛及熱量的敏感性較低，但偶爾會(huì)感到疼痛或灼痛感。在極少數(shù)情況下，受影響的患者會(huì)失去視力或逐漸喪失聽(tīng)力，甚至導(dǎo)致患者耳聾。盡管在大多數(shù)患者中，CMT不會(huì)影響預(yù)期壽命，較多患者僅產(chǎn)生中等程度的身體殘疾，癥狀輕微，甚至可能不會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床表型。但是，在極少數(shù)情況下，CMT也有可能會(huì)危及患者生命[5]。

根據(jù)遺傳方式，CMT可表現(xiàn)為常染色體顯性和隱性，以及X-連鎖顯性和隱性遺傳，其中以常染色體顯性遺傳多見(jiàn)，此外還有少數(shù)純合或復(fù)合雜合突變。根據(jù)神經(jīng)病理學(xué)和電生理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，CMT被分為2個(gè)類型：脫髓鞘型(CMT1)和軸突型(CMT2)，CMT2又包括CMT2A 、CMT2B和CMT2D等[6]。CMT2A(OMIM：608507)中最常見(jiàn)是MFN2基因突變，約占所有基因突變的20%。MFN2是CMT2主要的致病基因，突變頻率為8%～30%。MFN2是編碼線粒體GTP酶的核基因，與線粒體融合蛋白1、神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)分化相關(guān)蛋白1和視神經(jīng)萎縮1相互作用，對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)完整性、形態(tài)和運(yùn)輸至關(guān)重要[7]。MFN2通過(guò)影響氧化磷酸化而參與能量代謝[8]。MFN2與Ca2+的吸收調(diào)節(jié)有關(guān)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體的結(jié)合[9]。已有研究報(bào)道了罕見(jiàn)的MFN2復(fù)合雜合或純合突變病例[10]。這有助于擴(kuò)大與MFN2相關(guān)的神經(jīng)疾病的遺傳特征范圍。在臨床上，與MFN2相關(guān)的CMT2A發(fā)病特征可以從輕度的遲發(fā)性神經(jīng)疾病到嚴(yán)重的早發(fā)性神經(jīng)疾病[11]，其表型通常比單純的周圍神經(jīng)疾病復(fù)雜，有聽(tīng)力損失、視神經(jīng)萎縮或錐體束征等其他特征[12]。有研究報(bào)道了15例CMT2A患者，他們均是MFN2突變的復(fù)合雜合子或純合子攜帶者，具有常染色體隱性遺傳或半顯性遺傳，這些患者通常表現(xiàn)出嚴(yán)重的早期發(fā)作性神經(jīng)疾病，也有較輕的兒童期發(fā)病病例，有嚴(yán)重表型的患者通常會(huì)在30歲左右因下肢癱瘓需要乘坐輪椅，并合并其他發(fā)病特征[13-15]。已有研究表明，MFN2基因突變位點(diǎn)c.1090C>T的主要臨床癥狀是視神經(jīng)萎縮等，該位點(diǎn)位于MFN2蛋白高度保守的R3區(qū)，是1個(gè)突變熱點(diǎn)[16]。

在本研究的核心家系中，先證者、母親及妹妹均為MFN2基因c.1090C>T單堿基雜合突變，其父親在該位點(diǎn)為野生型，未見(jiàn)堿基突變。先證者主要顯示出輕度的營(yíng)養(yǎng)不良和下肢無(wú)力，發(fā)病時(shí)間為3歲左右；先證者母親8～9歲逐漸出現(xiàn)姿勢(shì)異常及肌肉萎縮，后出現(xiàn)癱瘓，現(xiàn)僅能獨(dú)坐，不能站立和行走，四肢纖細(xì)、消瘦，肌容積明顯減少；妹妹病史與先證者類似；先證者父親表型未見(jiàn)異常。先證者及其妹妹都表現(xiàn)出較早、較輕的兒童期發(fā)病，目前已經(jīng)采用手術(shù)矯正的方法逆轉(zhuǎn)其手足畸形，并配合其他方法盡量維持其肌肉的自主能力[17]。其母親因發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)且前期未做相關(guān)檢查和治療，目前已出現(xiàn)下肢癱瘓，無(wú)法行進(jìn)一步干預(yù)。由于目前無(wú)法采集到除該核心家系以外的先證者其他家族成員的基因，所以僅能推斷先證者及其妹妹的雜合突變來(lái)源于其母親，但是無(wú)法推斷其母親突變基因的來(lái)源，需要擴(kuò)大其家庭的臨床、神經(jīng)生理和分子研究，從而確定致病作用和遺傳模式的可能性。因此，在向患者及其家屬披露基因檢測(cè)結(jié)果和遺傳咨詢之前，需要仔細(xì)收集家族史并對(duì)健康的親屬進(jìn)行分析。此外，由于外顯率不完全，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)可能大不相同，必須將有關(guān)基因檢測(cè)的不確定性充分告知患者，以便患者可以更好地了解自己的病情。

綜上所述，本研究基于患者的臨床表型，以WES和PCR-Sanger測(cè)序方法，在1個(gè)核心家系中檢測(cè)并鑒定了3例攜帶MFN2基因單堿基雜合突變的患者。之前的報(bào)道顯示此突變主要是以視神經(jīng)萎縮為主要臨床癥狀，與本研究中報(bào)道的四肢發(fā)病特征不同，也證實(shí)了CMT具有明顯的臨床異質(zhì)性，常難以明確認(rèn)知和診斷，需要與其他疾病正確進(jìn)行區(qū)分。