李穎 董明華 張萌萌 孟芳 楊曉慧

三陰性乳腺癌是對人表皮生長因子受體2為靶點的靶向治療及雌激素受體、孕激素受體為受體的內(nèi)分泌治療一般無效的特殊乳腺癌類型，進(jìn)展快，預(yù)后差[1]。目前，化療是三陰乳腺癌治療的常規(guī)手段，紫杉醇是治療三陰乳腺癌的常規(guī)化療藥物之一[2]。但是化療藥物滲透性差，難以順利通過細(xì)胞膜，無法有效殺傷細(xì)胞。低頻超聲可通過空化效應(yīng)改變細(xì)胞膜通透性，增強化療藥物殺傷力，超聲微泡可以增強低頻超聲的空化效應(yīng)[3-4]。自噬是細(xì)胞降解或清除損傷細(xì)胞器并將代謝產(chǎn)物再利用的過程，適當(dāng)?shù)淖允煽杀Ｗo(hù)細(xì)胞自身，但劇烈的自噬反應(yīng)反而加速細(xì)胞凋亡。紫杉醇可誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬，導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生紫杉醇耐藥[5]。本研究觀察低頻超聲微泡技術(shù)對紫杉醇誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞自噬的影響。

材料與方法

一、試劑與儀器

人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468(貨號：YS-2032X)購自美國sciencell公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(德國merck/sigma)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(日本松下)中培養(yǎng)，傳代后取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.MTT法檢測MDA-MB-468細(xì)胞增殖：取MDA-MB-468細(xì)胞以1×105個/ml、每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板。按以下進(jìn)行分組：分組①加0、1、3、6、12、24 μg/ml紫杉醇，0 μg/ml紫杉醇為對照；分組②對照組(不進(jìn)行紫杉醇及低頻超聲微泡處理)、紫杉醇組(6 μg/ml紫杉醇)、低頻超聲組(聲強0.5 W/cm2、頻率1 MHz、輻照時間30秒+6 μg/ml紫杉醇)和低頻超聲微泡組(聲強0.5 W/cm2、頻率1 MHz、輻照時間30秒+6 μg/ml紫杉醇+5%微泡)。培養(yǎng)48小時，每孔加MTT溶液(美國AMEKO)20 μl，培養(yǎng)4小時，棄上清液，每孔加二甲基亞砜溶液150 μl，振蕩10分鐘，酶標(biāo)儀(美國BioTek)測定各孔吸光度(optical density，OD)值，計算增殖抑制率，增殖抑制率=(OD對照孔-OD實驗孔)/OD對照孔×100%。

3.流式細(xì)胞儀檢測MDA-MB-468細(xì)胞凋亡：按分組②處理，培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞，重懸為1×106個/ml，加入Annexin V-FITC/PI染液(哈爾濱新?；驒z測有限公司)5 μl，混勻、避光孵育20分鐘，流式細(xì)胞儀(美國Millipor)檢測細(xì)胞凋亡。

4.MDC染色檢測MDA-MB-468細(xì)胞自噬：按分組②處理，培養(yǎng)48小時，棄培養(yǎng)液，每孔加MDC染液(上海西格生物科技有限公司)10 μl，37 ℃孵育30分鐘，用1×Washbuffer漂洗后重懸，取細(xì)胞懸液滴片，熒光顯微鏡(日本Olympus)檢測并拍照。

5.蛋白免疫印跡法檢測各組MDA-MB-468細(xì)胞中凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況：按分組②處理，培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA測定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1小時，加入Bcl-2抗體、Bax抗體、Beclin1抗體、LC3抗體、GAPDH抗體(1∶500，美國abcam)，4 ℃孵育過夜，加羊抗兔二抗(1∶5 000，美國santa)，室溫孵育1小時，發(fā)光顯色，拍攝圖像，分析條帶灰度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1.不同濃度紫杉醇對MDA-MB-468細(xì)胞增殖的影響：1、3、6、12、24 μg/ml紫杉醇處理下MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率分別為(12.03±3.36)%、(25.37±4.85)%、(39.14±4.67)%、(51.85±4.23)%、(60.04±4.82)%，與0 μg/ml相比明顯升高(P<0.05)。

2.各組MDA-MB-468細(xì)胞增殖情況：與對照組相比，紫杉醇組MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率(38.77±4.82)%顯著升高(P<0.05)；與紫杉醇組相比，低頻超聲組MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率(49.86±4.65)%顯著升高(P<0.05)；與低頻超聲組相比，低頻超聲微泡組MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率(57.34±4.22)%顯著升高(P<0.05)。

3.各組MDA-MB-468細(xì)胞凋亡情況：與對照組(5.66±0.85)%相比，紫杉醇組MDA-MB-468細(xì)胞凋亡率(22.85±2.96)%顯著升高(P<0.05)；與紫杉醇組相比，低頻超聲組MDA-MB-468細(xì)胞凋亡率(39.74±3.68)%顯著升高(P<0.05)；與低頻超聲組相比，低頻超聲微泡組MDA-MB-468細(xì)胞凋亡率(46.58±3.56)%顯著升高(P<0.05)。見圖1。

4.各組MDA-MB-468細(xì)胞MDC染色情況：MDC染色結(jié)果顯示，自噬體呈綠色點狀結(jié)構(gòu)，與對照組相比，紫杉醇組MDA-MB-468細(xì)胞中綠色點狀物明顯增多；與紫杉醇組相比，低頻超聲組MDA-MB-468細(xì)胞中綠色點狀物明顯增多；與低頻超聲組相比，低頻超聲微泡組MDA-MB-468細(xì)胞中綠色點狀物明顯增多。見圖2。

圖1 各組MDA-MB-468細(xì)胞凋亡情況

圖2 各組MDA-MB-468細(xì)胞MDC染色情況(×400)

5.各組MDA-MB-468細(xì)胞中凋亡及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況：與對照組相比，紫杉醇組MDA-MB-468細(xì)胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與紫杉醇組相比，低頻超聲組MDA-MB-468細(xì)胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與低頻超聲組相比，低頻超聲微泡組MDA-MB-468細(xì)胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平顯著升高，LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖3、表1。

表1 各組MDA-MB-468細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較

圖3 各組MDA-MB-468細(xì)胞中Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)情況

討論

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率不斷升高，其致死率位居女性惡性腫瘤首位，嚴(yán)重影響女性生命健康[6]。我國每年乳腺癌發(fā)病例數(shù)約有16.9萬，占全球乳腺癌總發(fā)病例數(shù)的12.25%[7]。三陰性乳腺癌是一種特殊類型的乳腺癌，約占乳腺癌的10%～20%，與其它類型的乳腺癌相比，其因缺乏雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2表達(dá)，治療手段十分受限，復(fù)發(fā)性更強，臨床預(yù)后較差。化療是三陰性乳腺癌的主要治療手段之一，紫杉類、蒽環(huán)類藥物是三陰性乳腺癌化療的首選藥物。但是，用藥后細(xì)胞對藥物敏感性低在一定程度上限制了藥物的臨床應(yīng)用[8]。

近年來，超聲聯(lián)合微泡造影劑常用于輔助腫瘤化療、靶向治療。研究表明，低頻超聲可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞，破壞并抑制腫瘤組織增殖，在腫瘤治療方面已顯示出較好的應(yīng)用前景，具有穿透力強、組織衰減低及對正常細(xì)胞損傷小、對惡性腫瘤細(xì)胞敏感等特點，這既是低頻超聲用于治療腫瘤的優(yōu)越性，同時也是其安全性的理論基礎(chǔ)。微泡造影劑是一種直徑1～8 μm、內(nèi)含高密度惰性氣體、外有單層膜包裹的微氣泡，對聲壓具有較好的抵抗力。在低頻超聲的作用下，微泡造影劑發(fā)生不對稱的壓縮、膨脹，微泡震蕩頻率達(dá)到一定程度發(fā)生破裂，釋放出化療藥物，被稱為空化效應(yīng)[9]。超聲聯(lián)合微泡不僅能夠通過引起微聲流黏滯應(yīng)力，導(dǎo)致細(xì)胞骨架損傷及DNA鏈斷裂，還能夠增強細(xì)胞膜的通透性，有助于藥物通過細(xì)胞膜上的穿孔運輸至胞內(nèi)發(fā)揮作用。本研究通過紫杉醇濃度梯度對MDA-MB-468細(xì)胞增殖影響實驗，最終選擇6 μg/ml為紫杉醇處理濃度。使用紫杉醇處理MDA-MB-468細(xì)胞后，MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高，細(xì)胞中代表自噬體的綠色點狀物也明顯增多，表明紫杉醇不僅能抑制MDA-MB-468細(xì)胞增殖并引起細(xì)胞凋亡，還能引起細(xì)胞自噬。

自噬是細(xì)胞通過清除損壞的細(xì)胞器、多余的蛋白質(zhì)并再利用的過程，是細(xì)胞的一種自我保護(hù)機制，但在腫瘤治療中是一把“雙刃劍”。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬是腫瘤細(xì)胞發(fā)生化療耐藥的原因之一，如自噬可以通過胃癌中的AMPK/ATG5途徑促進(jìn)Metadherin誘導(dǎo)的化療耐藥性[10]。而采取措施抑制細(xì)胞自噬可增加細(xì)胞的藥物敏感性，減少耐藥發(fā)生，如二氯乙酸鹽可通過抑制非小細(xì)胞肺癌的自噬增強化學(xué)治療劑的抗腫瘤功效[11]。而有研究發(fā)現(xiàn)，過度的自噬會引起細(xì)胞的自噬性死亡，有助于化療藥物殺傷癌細(xì)胞，如α-倒捻子素可能主要通過誘導(dǎo)自噬性死亡而影響人胃癌細(xì)胞的活力[12]。高久蕉等[13]研究表明，LFS-01可通過阻斷CRM1運載蛋白出核、抑制STAT3信號通路的激活，從而促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468、MDA-MB-231發(fā)生自噬、細(xì)胞周期阻滯和凋亡。呂雨晨等[14]研究表明，地高辛能夠調(diào)節(jié)凋亡蛋白的改變，損傷線粒體膜電位，抑制癌細(xì)胞的活力，促進(jìn)其凋亡，并誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。本研究結(jié)果顯示，與紫杉醇組相比，低頻超聲組MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高，自噬體綠色點狀物明顯增多；與低頻超聲組相比，低頻超聲微泡組MDA-MB-468細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率顯著升高，自噬體綠色點狀物明顯增多，提示低頻超聲可增強紫杉醇誘導(dǎo)MDA-MB-468細(xì)胞的增殖抑制、凋亡、自噬反應(yīng)，且在此基礎(chǔ)上使用微泡可進(jìn)一步增強這些作用。Bcl-2、Bax是凋亡家族Bcl-2蛋白家族成員，分別在細(xì)胞凋亡過程中抗凋亡與促凋亡作用[15]。Beclin1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ均為自噬相關(guān)蛋白，其中，Beclin1在自噬起始起關(guān)鍵調(diào)控作用，LC3Ⅰ在自噬過程中逐漸向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化[5,15]。本研究結(jié)果顯示，隨著紫杉醇、低頻超聲、微泡逐步處理，MDA-MB-468細(xì)胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平依次顯著升高，Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)水平依次顯著降低，這進(jìn)一步證實了低頻超聲微泡對紫杉醇誘導(dǎo)MDA-MB-468細(xì)胞凋亡、自噬的增強作用。

綜上所述，低頻超聲微泡能夠提高M(jìn)DA-MB-468細(xì)胞中Bax、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白水平，降低Bcl-2、LC3Ⅰ蛋白水平，增強紫杉醇誘導(dǎo)三陰性乳腺癌MDA-MB-468細(xì)胞的增殖抑制、凋亡、自噬作用，在臨床上增強化療敏感性或減少化療抵抗方面具有良好前景。