周洪經(jīng)，吳敏，郭明日，張秀雯，張麗霞，孫海柏，秦中華

天津市海河醫(yī)院，天津300350

非結(jié)核分枝桿菌（NTM）是指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌）與麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌，目前為止共發(fā)現(xiàn)NTM 菌種175 種和13 個(gè)亞群，其中大部分為腐物寄生菌，僅少部分NTM 對人類致病，可侵犯肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織，并可引起全身播散性疾?。?］。近年來，NTM 感染的發(fā)病率呈上升趨勢，NTM 感染所帶來的危害性也逐漸被重視［2］。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，NTM 種屬分布具有地域特點(diǎn)，本研究觀察了2018—2019 年天津地區(qū)NTM 菌種分布及耐藥情況，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年12月天津市海河醫(yī)院分離出的NTM 菌株282 株，均分離自住院及門診患者，同一患者的多份菌株按一份計(jì)算。282例NTM 分離患者中，男182例、女100例，15～40歲者75例、40～60歲者84例、≥60歲者123例。

1.2 細(xì)菌、試劑與儀器 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv購自中國疾控中心。改良羅氏培養(yǎng)基及比例法藥物敏感試驗(yàn)培養(yǎng)基購自珠海貝索公司，全自動分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀（BACTEC MGIT960）系統(tǒng)及其配套試劑購自BD 公司，PCR 擴(kuò)增儀（ABI7500）、恒溫水浴鍋、晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、BioMixerTM芯片雜交儀、SlideWasherTM芯片干洗儀、Luxscan10K-B 微陣列芯片掃描儀購自北京博奧生物集團(tuán)有限公司。

1.3 NTM 菌種鑒定方法 采用微陣列基因芯片法。取BACTEC MGIT960培養(yǎng)陽性菌株的菌液200 μL加入核酸提取管中，95 ℃10 min 滅活，1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，向核酸提取管中加入50 μL核酸提取液，使用核酸提取儀振蕩5 min 后放入95 ℃水浴鍋中5 min，然后1 200 r/min離心1 min，取2 μL 于PCR 擴(kuò)增管中，加入擴(kuò)增試劑18 μL，用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物95 ℃變性5 min 后冰浴 3 min，取 6 μL 與 9 μL 雜交緩沖液混勻，將13.5 μL 雜交反應(yīng)混合物加到芯片上，將雜交盒密封后水平放入芯片雜交儀中，50 ℃雜交120 min。雜交后的芯片用干洗儀進(jìn)行洗滌和甩干，再通過掃描儀和相應(yīng)的軟件進(jìn)行掃描和結(jié)果判斷。

1.4 藥敏試驗(yàn)方法 參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）《M24-A 指南》標(biāo)準(zhǔn)，采用微量液體培養(yǎng)基最低抑菌濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。選取在羅氏培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的菌落，制作1 mg/mL的菌懸液備用；陰性對照空內(nèi)加入200 μL 的培養(yǎng)液，取100 μL 菌懸液加至培養(yǎng)液內(nèi)混勻，每個(gè)含藥空內(nèi)均加入200 μL 的含菌培養(yǎng)液；將含菌培養(yǎng)液進(jìn)行10 倍和100 倍稀釋，分別作為陽性對照1/10 參照孔和1/100 參照孔；將藥敏板密封后放入37 ℃溫箱中孵育；分別于第2、3、7 天觀察微孔板對照孔生長情況，判讀藥敏結(jié)果。藥敏板中抗菌藥物濃度見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)的抗菌藥物濃度（μg/mL）

2 結(jié)果

2.1 NTM 菌種分布 282 例 NTM 菌株分為 8 種，胞內(nèi)分枝桿菌占比最大，為29.08%（82/282），其次為龜/膿腫分枝桿菌（26.60%，75/282）和堪薩斯分枝桿菌（23.41%，66/282），鳥分枝桿菌占 9.57%（27/282）、偶然分枝桿菌占6.38%（18/282）、戈登分枝桿菌占3.19%（9/282）、瘰疬分枝桿菌占1.06%（3/282）、淺黃分枝桿菌占0.71%（2/282）。

2.2 NTM 對14種常用抗菌藥物的耐藥性 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，NTM 對異煙肼的耐藥率為100%，對氨基水楊酸、鏈霉素、卡那霉素和卷曲霉素的耐藥率均高于80%。不同NTM 菌種對14 種常用抗菌藥物的耐藥率有種間差異，胞內(nèi)分枝桿菌對利福布?。?.7%）和氯法齊明（6.1%）的耐藥率低，對其他抗菌藥物的耐藥率高；龜/膿腫分枝桿菌對異煙肼、鏈霉素和利福平的耐藥率為100%，對剩余11 種抗菌藥物的耐藥率也較高，均在90%以上；堪薩斯分枝桿菌對異煙肼、對氨基水楊酸和卡那霉素的耐藥率均高于80%，對利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星、莫西沙星、丙硫異煙胺、利福布汀、氯法齊明和利奈唑胺的耐藥率均低于10%；鳥分支桿菌對丙硫異煙胺、利福布汀和氯法齊明的耐藥率均較低（10%左右）；偶然分枝桿菌對左氧氟沙星和莫西沙星的耐藥率均低于30%；戈登分枝桿菌對左氧氟沙星、莫西沙星和利奈唑胺的耐藥率極低。NTM 對14 種常用抗菌藥物的耐藥率見表2。

表2 NTM對14種常用抗菌藥物的耐藥率（%）

3 討論

隨著診斷技術(shù)的進(jìn)步以及大眾對NTM 病危害認(rèn)識的提高，NTM 病的發(fā)病率呈上升趨勢，我國第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，NTM 在分枝桿菌 中 的 分 離 率 為 22.9%［3］，調(diào) 查 數(shù) 據(jù) 比 1990 年（4.9%）和2000 年（11.1%）全國流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果明顯升高。臨床上分離的致病NTM 菌株與菌種和分離出菌株的部位有關(guān)［4］，相關(guān)性較高的NTM 包括瑪爾摩分枝桿菌（95%）、蘇爾加分枝桿菌（76%）、鳥分枝桿菌復(fù)合群（56%）、膿腫分枝桿菌（35%）和龜分枝桿菌（31%），偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌和土分枝桿菌的臨床相關(guān)性較差（1%～3%）；從無菌部位分離出的NTM 多為致病菌，從非無菌部位如痰和支氣管灌洗液中分離出的NTM 要排除污染或呼吸道定植的可能。本研究檢測出8 種NTM，占據(jù)前三位的NTM 分別是胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌，與我院之前報(bào)道的前三位NTM 菌種一致［5］。我國其他地區(qū)的主要NTM 菌種分布為：北京地區(qū)以胞內(nèi)分枝桿菌（39.2%）和堪薩斯分枝桿菌（37.7%）為主［6］，柳州市區(qū)及周邊地區(qū)以鳥分枝桿菌（50.5%）和龜/膿腫分枝桿菌（27.1%）為主，廣州地區(qū)以膿腫分枝桿菌（34.0%）和胞內(nèi)分枝桿菌（25.2%）為主。這些研究證明了我國檢測出的優(yōu)勢菌及構(gòu)成比有地域差異，可能原因?yàn)椴煌貐^(qū)的氣候、土壤等環(huán)境的差異，導(dǎo)致該地區(qū)的優(yōu)勢菌不同。絕大多數(shù)NTM 來自于痰或灌洗液等呼吸道標(biāo)本，說明NTM 主要感染肺部；肺外NTM 感染以淋巴結(jié)炎最為常見，主要致病菌為鳥分枝桿菌復(fù)合群，在艾滋病患者中，鳥分枝桿菌引起的感染很常見；NTM 感染皮膚軟組織通常與特定人群有關(guān)，龜分枝桿菌或偶然分枝桿菌引起的傷口感染時(shí)見報(bào)道。NTM 肺病與肺結(jié)核病在臨床癥狀、影像學(xué)特征及病理學(xué)改變上常難以區(qū)分［7］，因此菌種鑒定對NTM 病的診斷具有重要意義。

用于治療NTM 病的藥物有限，治療效果不理想，美國胸科學(xué)會和美國傳染病學(xué)會建議在治療NTM 病前應(yīng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，有利于指導(dǎo)臨床用藥。本研究選取了14種抗結(jié)核藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，NTM 對多數(shù)抗結(jié)核藥高度耐藥，尤其是異煙肼耐藥率達(dá)100%，對鏈霉素、對氨基水楊酸、卡那霉素的耐藥率達(dá)80%以上，與相關(guān)文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致，部分NTM 對莫西沙星、丙硫異煙胺、利福布汀和氯法齊明的耐藥率低。不同的NTM 菌種對抗結(jié)核藥的耐藥率有一定差異，胞內(nèi)分枝桿菌對利福布汀和氯法齊明耐藥率低；龜/膿腫分枝桿菌耐藥率極高，對14種抗結(jié)核藥基本無作用；堪薩斯分枝桿菌對利福平、乙胺丁醇、左氧氟沙星、莫西沙星、丙硫異煙胺、利福布汀、氯法齊明和利奈唑胺耐藥率低；鳥分枝桿菌對莫西沙星、丙硫異煙胺、利福布汀、氯法齊明耐藥率較低；偶然分枝桿菌對左氧氟沙星和莫西沙星耐藥率較低。2012 年《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識》推薦大環(huán)內(nèi)酯類（克拉霉素和阿奇霉素）、氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物治療龜/膿腫分枝桿菌和偶然分枝桿菌；臨床常見慢生長分枝桿菌包括胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌，治療通常選用大環(huán)內(nèi)酯類和利福霉素類藥物，有時(shí)加注射類抗結(jié)核藥。因此NTM 病應(yīng)在菌種鑒定的基礎(chǔ)上，選擇合適的抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

綜上所述，2018—2019年天津地區(qū)NTM 菌株有8 種，以胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌為主。不同NTM 菌種對14 種常用抗菌藥物的耐藥率有種間差異，對常規(guī)抗菌藥物耐藥率高，因此NTM 病治療時(shí)應(yīng)進(jìn)行菌種鑒定，選擇合適的抗菌藥物。