苑園園

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北衡水053000）

橘皮約占橘子質(zhì)量的四分之一，不僅含有維生素、果膠、色素，而且富含多糖。目前研究顯示，多糖具有降血糖[1-2]、抗惡性腫瘤[3]以及抗氧化[4]等重要生理活性。選取橘皮提取多糖，還可解決橘皮利用不當(dāng)造成的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問(wèn)題，大大提高了橘皮的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益。

目前，常用的提取多糖的方法有酸堿溶劑法、酶解法、微波輔助法和超聲波輔助法[5]。然而，以上單一法的提取效果有限，所以在提取過(guò)程中通常需要采用將幾種方法組合使用，以提高多糖產(chǎn)率。例如，吳瓊等[6]比較了相同條件下提取黑木耳多糖，超聲波協(xié)同酶解法優(yōu)于熱水法和超聲波輔助熱水法。張素斌等[7]比較了不同提取方法對(duì)竹蓀多糖產(chǎn)率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲協(xié)同復(fù)合酶法效果優(yōu)于熱水浸提法、超聲波輔助法和復(fù)合酶法。陳艷等[8]提取松茸多糖，發(fā)現(xiàn)超聲協(xié)同復(fù)合酶法比單一超聲波輔助法多糖產(chǎn)率提高了8.38%。

目前，超聲波協(xié)同酶解法提取橘皮多糖的研究鮮有報(bào)道。超聲波主要通過(guò)機(jī)械剪切對(duì)原料進(jìn)行破碎，加上酶對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞作用，可使細(xì)胞內(nèi)多糖更好地溶出[9]。本研究基于這兩種提取方法的優(yōu)點(diǎn)，處理分析單因素的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用響應(yīng)面法對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化[10]，為深入開發(fā)橘皮多糖提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘：市購(gòu)；葡萄糖：天津市大茂化學(xué)試劑廠；濃硫酸（分析純）：煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；纖維素酶（100 000 U/g）、果膠酶（50 000 U/g）：北京益緯生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-8060 MED）：北京拜達(dá)制造有限公司；超聲波清洗機(jī)（0080ST）：杭州榮華機(jī)械設(shè)備有限公司；電子天平（AX224ZH/E）：江蘇國(guó)藝科技發(fā)展有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-3）：山東友誠(chéng)科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-100）：深圳向帆儀器制造有限公司；搖擺式粉碎機(jī)（LD500）：杭州塞旭食品機(jī)械有限公司；便攜式pH 計(jì)（ST100）：蘇州漢星分析有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橘皮的預(yù)處理

將橘皮置于55 ℃干燥箱干燥8 h 至質(zhì)量不再變化。冷卻后用粉碎機(jī)碾碎至粉末狀，保存于干燥密封袋。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖100 mg，置于1 000 mL 容量瓶中定容，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液[11]。依次吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL 置于試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL[12]。準(zhǔn)確吸取樣液1.0 mL，加入6%苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，測(cè)定490 nm 下吸光度值[13-14]。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)[15]，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 橘皮中多糖的提取工藝

準(zhǔn)確稱取1.000 g 的橘皮粉，將物料與溶劑（即蒸餾水）按一定的比例配制好，用磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)pH 值，加入復(fù)合酶后放在恒溫水浴鍋中提取60 min，酶解完成后80 ℃滅酶15 min，超聲一定時(shí)間，取上清液1.0 mL，定容于100 mL 容量瓶中，即得多糖樣液[16]。按1.3.2 方法測(cè)定吸光度值，代入回歸參數(shù)方程計(jì)算多糖產(chǎn)率。

多糖產(chǎn)率/%=NCV/M×100

式中：N 是稀釋倍數(shù)；C 為多糖溶液的濃度，mg/mL；M 為橘皮樣品的質(zhì)量，g；V 是多糖提取液的體積，mL。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 復(fù)合酶提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1.000 g 橘皮粉5 份，用磷酸氫二鈉和檸檬酸緩沖液將pH 值調(diào)節(jié)為5.0，復(fù)合酶（纖維素酶∶果膠酶）的質(zhì)量比設(shè)為1 ∶2、1 ∶1、3 ∶2、2 ∶1、5 ∶2，復(fù)合酶的用量設(shè)為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，酶解溫度設(shè)為40、45、50、55、60 ℃，酶解時(shí)間設(shè)為30、40、50、60、70 min，研究復(fù)合酶的質(zhì)量比、復(fù)合酶用量、酶解溫度、酶解時(shí)間4 個(gè)因素對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響。

1.3.4.2 超聲輔助提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1.000 g 橘皮粉5 份，在超聲波固定功率480 W 下，將料液比設(shè)為1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL），將超聲溫度設(shè)為40、50、60、70、80 ℃，將超聲時(shí)間設(shè)為5、10、15、20、25 min，研究超聲輔助提取的料液比、溫度、時(shí)間對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用單因素試驗(yàn)法確定多糖產(chǎn)率的7 個(gè)影響因素的最優(yōu)水平后，再用Box-Behnken 模型對(duì)顯著性影響因素進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)四因素三水平的方法，確定提取橘皮多糖的最佳工藝條件[17]，顯著性因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化多糖產(chǎn)率

2.1.1 復(fù)合酶用量

復(fù)合酶用量對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響見圖1。

圖1 復(fù)合酶用量對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of compound enzyme dosage on polysaccharide yield of orange Peel

圖2 復(fù)合酶質(zhì)量比對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of compound enzyme mass ratio on polysaccharide yield of orange peel

圖2 可以看出，多糖產(chǎn)率隨復(fù)合酶質(zhì)量比（纖維素酶∶果膠酶）的不同先升高后逐漸下降，在復(fù)合酶質(zhì)量比1 ∶1 時(shí)達(dá)到31.80%的峰值。原因可能與橘皮中纖維素與果膠的含量有關(guān)，橘皮中纖維素與果膠的含量比例接近1 ∶1，纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比1 ∶1 時(shí)，能更好地破壞橘皮細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)，使細(xì)胞中的多糖更易溶出[18]。

2.1.3 酶解溫度

酶解溫度對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on polysaccharide yield of orange peel

圖3 可以看出，多糖產(chǎn)率隨溫度先升高后逐步降低，在50 ℃時(shí)達(dá)到30.90%的峰值。溫度過(guò)高使酶活性降低，所以橘皮多糖的產(chǎn)率會(huì)逐漸降低。故此，50 ℃為最佳酶解溫度。

2.1.4 酶解時(shí)間酶解時(shí)間對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on polysaccharide yield of orange peel

圖4 可以看出，多糖產(chǎn)率隨酶解時(shí)間先增高后降低。在反應(yīng)時(shí)間60 min 以內(nèi)，多糖產(chǎn)率與之成正比，但反應(yīng)時(shí)間超60 min 時(shí)，高溫條件下部分多糖被水解，導(dǎo)致產(chǎn)率下降。因此，60 min 為最佳酶解時(shí)間。

2.1.5 料液比

料液比對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of material liquid ratio on polysaccharide yield of orange peel

圖5 可以看出隨著溶劑體積的增大，多糖產(chǎn)率先升高后下降，在料液比為1 ∶30 （g/mL）時(shí)達(dá)到峰值30.42%；當(dāng)溶劑比例過(guò)高時(shí)，溶劑吸收大部分超聲波能量，使細(xì)胞內(nèi)多糖溶解較少，降低了產(chǎn)率[19]。所以，1 ∶30（g/mL）為最佳料液比。

2.1.6 超聲溫度

超聲溫度對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響見圖6。

圖6 可以看出，在70 ℃以下時(shí)，多糖產(chǎn)率與超聲溫度成正比，70 ℃時(shí)達(dá)到29.97%的峰值。但溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，高溫條件下多糖被水解，所以產(chǎn)率驟然降低。因此，超聲的最佳溫度為70 ℃。

2.1.7 超聲時(shí)間

超聲時(shí)間對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響見圖7。

圖7 可以看出，在一定時(shí)間內(nèi)，多糖產(chǎn)率與超聲時(shí)間成正比，但超聲超過(guò)一定時(shí)間，部分多糖在超聲波的機(jī)械剪切和熱作用下被破壞分解，所以產(chǎn)率下降。故

圖6 超聲溫度對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharide yield of orange peel

圖7 超聲時(shí)間對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield of orange peel

此，最佳的超聲時(shí)間為20 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results of response surface

系統(tǒng)所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 軟件進(jìn)行多元回歸方程的計(jì)算分析，得到的方程如下。

Y=32.67+0.73A+0.98B+0.48C+1.42D+0.27AB+0.090AC-1.26AD+0.18BC+0.90BD+0.21CD-1.83A2-1.62B2-1.92C2-3.50D2

回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

表3 表明，該模型的F 值為27.08，P 值＜0.000 1，說(shuō)明了該模型的重要性。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.964 4，較正決定系數(shù)R2Adj=0.928 8，這表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)符合程度達(dá)到96.44%，只有3.56%變異不能由該模型來(lái)解釋。失擬項(xiàng)P=0.430 0 ＞0.05，可知失擬不顯著，說(shuō)明該模型能較好地模擬和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)誤差較小[20]。方程的一次項(xiàng)中A、B、D 對(duì)結(jié)果有極顯著影響，即酶解溫度和酶解時(shí)間、超聲時(shí)間；另外，料液比對(duì)結(jié)果有顯著影響，二次項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都有極顯著作用，交互項(xiàng)中以AD 交互作用最為顯著，其它交互作用對(duì)橘皮多糖產(chǎn)率的影響不大。借助Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)表中的目標(biāo)因素進(jìn)行整合完善，圖8 為4個(gè)因素之間相互作用對(duì)多糖產(chǎn)率影響的響應(yīng)面圖。

圖8 4 個(gè)因素之間相互作用對(duì)多糖產(chǎn)率的影響Fig.8 Effect of interaction among four factors on polysaccharide yield

用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得到方程極值點(diǎn)，即：酶解溫度51.76 ℃、酶解時(shí)間63.89min、料液比為1 ∶31.69（g/mL）、超聲時(shí)間21.25min。理論上，多糖產(chǎn)率的預(yù)估值是33.113 9%。

2.3 最優(yōu)條件的驗(yàn)證試驗(yàn)

為便于實(shí)際操作，將影響橘皮多糖產(chǎn)率的4 個(gè)主要因素的最優(yōu)水平調(diào)整為：酶解溫度52 ℃，酶解時(shí)間64 min，料液比為1 ∶32（g/mL），超聲時(shí)間21 min，并進(jìn)行3 個(gè)平行試驗(yàn)，求得橘皮多糖產(chǎn)率的均值是33.02%，與預(yù)測(cè)的結(jié)果相差0.91%，說(shuō)明該模型的分析準(zhǔn)確度和可信度較高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首次將復(fù)合酶酶解法與超聲輔助提取法結(jié)合，用于橘皮多糖的提取。首先，用單因素試驗(yàn)法確定了多糖產(chǎn)率的7 個(gè)影響因素的最優(yōu)水平，再用Box-Behnken 中心組合分析法對(duì)顯著性影響因素進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳的提取工藝為：酶解溫度52 ℃，酶解時(shí)間64 min，料液比為1 ∶32（g/mL），超聲時(shí)間21 min，在該條件下，橘皮多糖產(chǎn)率為33.02%，該方法提取效率較高，為進(jìn)一步的試驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。