李長安，劉春秀，謝曉娟，孫愛平

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 感染科，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床最常見的原發(fā)惡性腫瘤之一，每年全球新增肝癌患者高達(dá)63萬例，病死率居于各種惡性腫瘤的第二位。目前，HCC最重要的治療方法仍是手術(shù)切除[1-2]，但是外科手術(shù)切除具有嚴(yán)格的手術(shù)指征，且術(shù)后存在較高的復(fù)發(fā)率。部分肝癌患者在就診時已屬于肝癌晚期，就診時已喪失了最佳手術(shù)時機，因此，尋找HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要臨床意義。Notch1信號通路是參與多種細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡的重要通路[3]。而PI3K/Akt/mTOR信號途徑在細(xì)胞增殖、分化等生理過程中發(fā)揮重要作用。Notch1蛋白的表達(dá)可能參與了Akt/mTOR信號通路的激活[4]。自噬是高度保守的生命現(xiàn)象，主要是指細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成有用的物質(zhì)供細(xì)胞利用，并排出廢物的過程，其貫穿了細(xì)胞的增殖、分化及凋亡各個階段。本研究觀察了Notch1基因的表達(dá)對肝細(xì)胞癌的增殖、凋亡及細(xì)胞內(nèi)自噬水平及Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料：選擇2017年1月至2019年12月于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院行肝癌手術(shù)治療患者的肝癌組織32例作為肝癌組，同一部位的癌旁組織作為癌旁組。所有患者均于術(shù)后行病理檢查，確診為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，并依據(jù)美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)第七版TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期，所有患者術(shù)前均未給予放療、化療或者靶向治療等抗腫瘤措施，且均未發(fā)現(xiàn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。所有患者均知情同意，并簽署知情同意書。且本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號：20170119)。

1.1.2 試劑：人肝癌細(xì)胞系HepG2(ATCC公司)；RPMI1640培養(yǎng)液及胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)；AmiexinV/PI雙染試劑盒(BD公司)；Notch1、BCL-2、Bax、cleaved caspase-3、Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K和β-actin鼠抗人一抗(均Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：用含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃、5% CO2、飽和濕度，當(dāng)細(xì)胞呈對數(shù)增殖期時進(jìn)行后續(xù)實驗。以2×106個/孔接種于6孔培養(yǎng)板上，分別設(shè)置對照組、NC siRNA組及Notch1 siRNA組，每組均設(shè)3個復(fù)孔。將Opti-MEM 250 μL與LipofetamineTM2000 15 μL、NC siRNA對照1.0 μg、Notch1 siRNA1.0進(jìn)行稀釋，并于24 ℃下放置5 min后與NC siRNA及Notch1 shRNA混合，于24 ℃下放置20 min，并將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入含有細(xì)胞的無抗培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，檢測Notch1 mRNA及蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.2 熒光定量PCR檢測Notch1 mRNA的表達(dá)：RNA提取試劑盒提取肝癌組織及細(xì)胞的總RNA并合成cDNA。使用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR的檢測。引物由Invitrogen公司設(shè)計并合成。引物序列：Notch1上游引物:5′-GCCTCAA CATCCCCTACAAGA-3′，下游引物:5′-CCACGAAG AACAGAAGCACAAA-3′；β-actin上游引物:5′-CG AGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′，下游引物:5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACA TCTGC-3′。PCR擴(kuò)增步驟95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，共40個循環(huán)，并加測溶解曲線以驗證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。數(shù)據(jù)以2-△△Ct法進(jìn)行分析。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞的增殖：轉(zhuǎn)染48 h后，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，分別于24、48、72和96 h收集細(xì)胞，將細(xì)胞置于96孔板中，每孔分別加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心后棄去上清，每孔加入DMSO 150 μL，避光條件下振蕩混勻10 min，在492 nm和630 nm的波長上檢測細(xì)胞的增殖率，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞測量術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡：轉(zhuǎn)染48 h后，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，嚴(yán)格按照AnnexinV和PI雙染試劑盒的說明書處理細(xì)胞，流式細(xì)胞測量術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率。

1.2.5 蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白、自噬相關(guān)蛋白及對Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)：轉(zhuǎn)染48 h后，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，離心收集細(xì)胞，加入含有磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量后，給予SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗，4 ℃過夜后，加入1∶5 000比例的二抗，24 ℃孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，以β-actin為內(nèi)參照，AlphaDigiDoc圖像分析軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Notch1基因在肝癌組織中的表達(dá)

Notch1基因在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中的相對表達(dá)量為(1.865±0.791)，顯著高于癌旁組織的(0.709±0.414)(P<0.001)。

2.2 下調(diào)Notch1的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖

Notch1 siRNA組中Notch 1 mRNA及蛋白的表達(dá)均顯著低于NC siRNA組和對照組(P<0.001)(圖1A～C)。提示Notch1 siRNA轉(zhuǎn)染成功，Notch1的表達(dá)被成功抑制。 Notch1 siRNA組24、48、72及96 h的細(xì)胞增殖率顯著低于陰性對照組及空白對照組(P<0.001)(圖1D)。

2.3 下調(diào)Notch1的表達(dá)對肝癌細(xì)胞凋亡的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，Notch1 siRNA組細(xì)胞的凋亡率顯著高于NC siRNA組和對照組(P<0.001)。且Notch1 siRNA組細(xì)胞的Bax水平顯著高于NC siRNA組和對照組，Bcl-2、cleaved caspase-3的表達(dá)顯著低于NC siRNA組和對照組(P<0.001)(圖2)。

2.4 下調(diào)Notch1的表達(dá)對肝癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，Notch1 siRNA組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beelinl、ATG7和ATG5的表達(dá)量顯著高于NC siRNA組和對照組(P<0.001)(圖3)。

2.5 下調(diào)Notch1的表達(dá)對肝癌細(xì)胞中Akt/mTOR信號途徑相關(guān)蛋白的影響

轉(zhuǎn)染48 h后，Notch1 siRNA組的mTOR信號途徑相關(guān)蛋白p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K表達(dá)量顯著低于NC siRNA組和對照組(P<0.001)(圖4)。

3 討論

惡性腫瘤的病理形成過程發(fā)生發(fā)展中伴隨著Notch信號通路的異?；罨痆5-6]。Notch1是Notch受體中與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系最為密切的基因。Notch1在肝細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率均高于癌旁肝硬化和癌旁正常組織，其對肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用[7]。干擾Notch1的表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。因此，Notch1在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌基因的作用。本研究結(jié)果顯示，Notch1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中的相對表達(dá)量顯著高于癌旁組織。同時，下調(diào)Notch1的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞HepG2 24、48、72及96 h的細(xì)胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著增高，Bax水平顯著增高，Bcl-2、cleaved caspase-3的表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步證實了Notch1在肝癌組織中呈高表達(dá)，且其與肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡密切相關(guān)。

A.expression of Notch1 protein detected by Western blot; B.bar graph of Notch1 protein expression; C.expression of Notch1 mRNA detected by fluorescence quantitative PCR; D.cell protiferation detected by MTT method;*P<0.001 compared with control and NC group

A： apoptosis of liver cancer cells by flow oytometry；B：expression of apoptosis-related proteins detected by Western blot; *P<0.001 compared with control and NC group

A.expression of autophagy-related proteins by Western blot; B.bar graph of autophagy-related protein expression;*P<0.001 compared with control group and NC group

A.expression of Akt/mTOR signaling pathway related proteins by Western blot; B.bar graph of Akt/mTOR signaling pathway related proteins expression;*P<0.001 compared with control group and NC group

自噬是細(xì)胞代謝過程進(jìn)行自我消化的正常生理過程，在此過程中細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)由溶酶體降解并重新利用，同時排出代謝廢物，這一過程貫穿于細(xì)胞的全部生命活動過程中，對于維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、修復(fù)機體病理損傷發(fā)揮積極作用[9-10]。因此，在腫瘤細(xì)胞中提高細(xì)胞的自噬水平有利于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與發(fā)展。LC3B、Beelinl、ATG7和ATG5是機體自噬過程中重要的標(biāo)志性蛋白[11-12]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，Notch1 siRNA組細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beelinl、ATG7和ATG5的表達(dá)量顯著高于NC siRNA和對照組，提示抑制Notch1的表達(dá)可有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞的自噬。

P13K-Akt-mTOR信號通路在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)激活狀態(tài)，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13-14]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中P13K-AKT-mTOR信號通路的表達(dá)上調(diào)，而給予mTOR抑制劑成功阻斷該通路后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬水平顯著升高，抑制腫瘤生長[15]。同時，Notch1基因與P13K-AKT-mTOR信號通路的激活密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中阻斷Notchl后，P13K-AKT-mTOR信號通路的活性也被抑制，細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，Notch1 shRNA組的mTOR信號途徑相關(guān)蛋白p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K表達(dá)量顯著低于NC siRNA和對照組，提示下調(diào)Notch1的表達(dá)能夠降低Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平，抑制該通路的激活，而其抑制Notch1的表達(dá)可有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞的自噬可能與此有關(guān)。

綜上所述，Notch1在原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中呈高表達(dá)，而下調(diào)Notch1的表達(dá)可顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，提高細(xì)胞的自噬水平，其機制可能與抑制Akt/mTOR信號通路有關(guān)。