王衛(wèi)國，王偉偉，馬黎麗（阜陽市人民醫(yī)院檢驗科，安徽阜陽 236001）

傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM）是兒童較為常見的急性傳染病，由EB病毒感染導致，發(fā)病后淋巴細胞快速增生，外周血反應性淋巴細胞即異型淋巴細胞迅速增高，導致發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、咽峽炎等臨床癥狀出現(xiàn)[1]。IM患兒機體免疫系統(tǒng)應答迅速，致使病毒靜息下來，絕大多數(shù)形成潛伏感染，若免疫應答低下或過度可形成慢性活動性EB病毒感染或嗜血細胞綜合癥，造成不同的疾病和臨床結(jié)局[2]。程序性死亡分子1（programmed death 1，PD-1）和T細胞免疫球蛋白及黏蛋白分子3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，Tim-3）是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的負性免疫調(diào)節(jié)分子，在抗病毒和維持免疫自穩(wěn)中起著重要作用，乙肝、丙肝和艾滋病等患者中均發(fā)現(xiàn)PD-1和Tim3表達異常[3-4]。PD-1和Tim-3 在兒童IM患者T細胞及血漿中如何表達，目前報道較少，本研究旨在探討上述指標的表達變化及其臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2018年3月～2020年2月于阜陽市人民醫(yī)院確診的IM患兒67例，診斷標準參照《諸福棠實用兒科學》（第8版），男性47例，女性20例，年齡1～8歲，平均年齡3.56±1.91歲。對照組為健康體檢者20例，男性13例，女性7例，年齡1～9歲，平均年齡3.60±2.23歲。兩組間在性別和年齡上的差異無統(tǒng)計學意義。此次研究通過了本院醫(yī)學倫理委員會的批準。

1.2 試劑和儀器 CD3，CD4，CD8，PD-1，Tim-3，CD45 及相關(guān)同型對照熒光標記抗體購自BD 公司；人血漿PD-1和Tim-3檢測ELISA試劑購自江萊生物公司；芬蘭雷勃mk3 酶標儀和美國BD Calibur 流式細胞儀。

1.3 方法

1.3.1 T細胞PD-1和Tim-3表達檢測:取四支流式管，每種抗體用量為10 μl。第1 和第2 支加入CD3，CD4 和CD45 后，再分別加入PD-1和Tim-3，第3 和第4 支加入CD3，CD8 和CD45 后，再分別加入PD-1和Tim-3，各管加入50 μl EDTA 抗凝全血，避光染色30 min，溶血后離心棄上清，加入磷酸鹽緩沖液上機檢測。cell quest 軟件分析，以百分比（%）表示PD-1和Tim-3 在CD4+和CD8+T細胞上的表達。

1.3.2 血漿PD-1和Tim-3的水平檢測:按試劑盒操作說明書進行：樣本孔和標準品孔各加50 μl 樣品和辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μl，封板后37℃孵育30 min，洗滌5次后加入酶作用底物，15 min 后加入終止液，于酶標儀450 nm 波長讀取吸光度值，采用曲線回歸方程計算血漿PD-1和Tim-3濃度（ng/ml）。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 18.0 軟件，正態(tài)分布資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗、t’檢驗和相關(guān)性分析，繪制ROC曲線，評估其診斷的價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IM組和對照組T細胞上PD-1，Tim-3表達百分比比較 見表1，圖1。與對照組比較，IM患兒CD4+T 和CD8+T細胞上PD-1和Tim-3表達百分比均明顯升高（均P＜0.01）。

表1 IM組和對照組CD4+和CD8+ T細胞上PD-1和Tim3表達百分比（%）比較

圖1 PD-1和Tim-3表達流式圖

2.2 IM組和對照組血漿PD-1及Tim-3水平比較 見表2。與對照組比較，IM患兒血漿PD-1和Tim-3濃度明顯升高（均P＜0.01）。ROC曲線分析，血漿PD-1和Tim-3濃度診斷IM的曲線下面積分別為0.794（95%可信區(qū)間為0.694～0.894，P=0.000）和0.722（95%可信區(qū)間為0.611～0.833，P=0.003），Youden指數(shù)最大點對應的診斷界值分別為1.24 ng/ml 和0.44 ng/ml，血漿PD-1的敏感度和特異度分別為62.7%和85.0%，血漿Tim-3的敏感度和特異度分別為65.7%和75.0%，兩者聯(lián)合診斷的敏感度和特異度分別為52.2%和95.0%，ROC曲線見圖2。相關(guān)性分析，血漿PD-1和Tim-3水平呈正相關(guān)（r=0.63，P＜0.01）。

表2 IM組和對照組血漿PD-1 及Tim-3水平（ng/ml）比較

3 討論

細胞免疫異常是EB病毒感染后發(fā)病和轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)[5-6]：急性期IM患者CD8+T細胞迅速增加；CD4+T細胞分化漂移，效應性Th1細胞增加；具有免疫抑制作用的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞和CD4-CD8-雙陰性T細胞增加等，表明IM患者抗病毒和抑制性免疫反應可同時存在。

圖2 PD-1，Tim-3的ROC曲線

本次實驗發(fā)現(xiàn)：較對照組，IM患兒CD4+和CD8+T細胞表面PD-1 及Tim-3表達明顯升高，血漿中PD-1和Tim-3水平明顯升高。PD-1 在活化的淋巴細胞中誘導性的表達上調(diào)，能抑制T細胞增殖和IL-2 產(chǎn)生，許多病毒和腫瘤均是通過PD-1 途徑逃避機體的免疫防御和監(jiān)視。CD4+T細胞主要包括輔助性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞，IM患者不論哪種類型CD4+T細胞PD-1表達增加，都導致機體快速清除病毒的能力減弱，而且會導致CD8+T細胞向效應性的細胞毒性細胞分化減少。CD8+T細胞主要包括抑制性和細胞毒性細胞，IM患兒CD8+T細胞PD-1表達升高，從理論上講是促進抑制性功能和減弱細胞毒作用，但CHATTERJEE 等[7]發(fā)現(xiàn)PD-1 陽性CD8+T細胞保留了增殖、細胞因子產(chǎn)生和細胞毒性的能力，而且在EB病毒特異性細胞毒性CD8+T 上也發(fā)現(xiàn)升高的PD-1表達[6]，提示IM患兒PD-1表達升高可能在抗病毒和維持過度的免疫應答方面都起著一定的作用。Tim-3 負性調(diào)節(jié)T細胞的應答反應，過表達能引起病毒感染過程中T細胞的衰竭，引起免疫功能無能。研究發(fā)現(xiàn)越來越多的腫瘤細胞對抗PD-1 發(fā)生耐藥，而抗Tim-3和抗PD-1 聯(lián)合用藥可以解決該問題[8]，也證明了Tim-3 在免疫抑制中的關(guān)鍵作用。與其他免疫檢查點分子不同，Tim-3 不是在所有的T細胞活化后表達增加，只在Th1 和具有細胞毒作用的CD8+T 中表達上調(diào)。IM患兒CD4+和CD8+T細胞Tim-3表達增高，提示兩種主要的抗病毒效應細胞存在免疫功能被抑制。血漿PD-1和Tim-3 主要來自于膜型分子的裂解或細胞基因編碼產(chǎn)生，不論是膜型還是可溶性分子，均與受體結(jié)合的信號途徑發(fā)揮作用。PD-1和Tim-3 與其受體的信號途徑可致使病毒特異性T細胞的失能及耗竭，IFN-γ，IL-2 和TNF等抗病毒的細胞因子水平降低，導致病毒感染的持續(xù)或潛伏[8-9]，但新的研究似乎并不支持PD-1 抗體應用于EBV感染。ROC曲線顯示：血漿PD-1和Tim3濃度對診斷IM的靈敏度不佳，而特異度較好，兩者聯(lián)合診斷IM的特異度可達95%，顯示其血漿水平在排除性診斷中具有一定的價值。IM患兒血漿PD-1和Tim3水平呈正相關(guān)，提示兩者在抑制性功能上具有協(xié)同作用。

綜上所述，IM患兒PD-1和Tim表達水平升高，一方面降低了免疫應答，另一方面可能預防了過激的免疫反應，維持機體相對的免疫自穩(wěn)，致使病毒靜息和潛伏起來。