韋 悅，李文宇，范潤哥，侯 偉，溫斯健△，林有坤△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科，南寧 530021；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院地中海貧血防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021；3.廣西地中海貧血防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種以自身抗體產(chǎn)生及多器官受累為主要特點(diǎn)的自身免疫性疾病[1]，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，既往研究認(rèn)為其與遺傳、免疫、環(huán)境、激素水平等有關(guān)，而近來，表觀遺傳學(xué)在SLE 發(fā)病中的作用越來越受到重視[2-4]。功能性的非編碼RNA 對(duì)基因的調(diào)控作為表觀遺傳學(xué)中的重要機(jī)制之一，在SLE的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5-6]。環(huán)狀RNA 是一類環(huán)狀非編碼RNA 分子，可通過“miRNA 海綿”等機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。本課題組前期通過高通量測序技術(shù)檢測了SLE 患者及健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中環(huán)狀RNA的表達(dá)，通過進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出了hsa_circ_0006689。本研究以該前期工作為基礎(chǔ)，擴(kuò)大樣本進(jìn)一步探究hsa_circ_0006689在SLE中的表達(dá)并驗(yàn)證其生物學(xué)特性，并初步探討其在SLE中可能的作用機(jī)制，為尋找新的SLE生物標(biāo)記物提供科學(xué)依據(jù)，為SLE的發(fā)病機(jī)制研究提供新的視角及思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科2019年3月至2020年9月收治的30例SLE患者（觀察組）和34例健康志愿者（對(duì)照組）作為研究對(duì)象。觀察組中女27例，男3例，年齡12～59 歲，平 均（31.8±13.6）歲，均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)（ACR）1997年制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，且已排除嚴(yán)重感染、妊娠、惡性腫瘤、糖尿病及其他自身免疫性疾病[7]。對(duì)照組均為女性，年齡18～26歲，平均（22.76±2.28）歲，滿足以下幾個(gè)條件：（1）非SLE患者，且無其他自身免疫疾??；（2）無重大疾??；（3）近3 個(gè)月來無使用激素、免疫抑制劑等藥物。依據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)性指數(shù)（systemic lupus erythematosus activity index，SLEDAI）[8]對(duì)觀察組進(jìn)行評(píng)分并分組，將觀察組中處于活動(dòng)期的24例患者（SLEDAI 評(píng)分≥5）設(shè)為活動(dòng)組，6例穩(wěn)定期患者（SLEDAI 評(píng)分＜5）設(shè)為非活動(dòng)組。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（NO.倫審[2017-KY-國基-081]），受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS）、人外周血單個(gè)核細(xì)胞分離液（北京索萊寶公司）；Trizol RNA分離試劑、lipofectamine TM2000（美國invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA 公司）；2×Universal SYBR Green Fast qPCR mix（武漢愛博泰克公司）；hsa_circ_0006689、ACTB 引物（上海生工生物工程公司）；RNase R（美國epicentre 公司），胎牛血清、DMEM、Opti-MEM（美國GIBCO公司），Dual-Luciferase Reporter Assay System（美國Promega 公司）。Lightcycle 96 熒光定量PCR 儀（美國Roche 公司），熒光顯微鏡（德國LEICA 公司），超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司），酶標(biāo)儀（TECAN公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC提取 根據(jù)人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液的操作說明，分離收集3 mL新鮮全血中的PBMC用于后續(xù)RNA提取。

1.3.2 RNA 提取與逆轉(zhuǎn)錄 使用Trizol 試劑提取PBMC 中的總RNA，用分光光度計(jì)測量RNA 的濃度及純度，隨后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑操作說明在T100 Thermal cycler PCR儀上合成cDNA。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測 通過circ-Base 網(wǎng)站（http://www.circbase.org/）獲取hsa_circ_0006689 的序列，將序列頭尾相接，使用NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物須包含環(huán)化位點(diǎn)，以ACTB為內(nèi)參，引物序列見表1，qPCR 反應(yīng)體系，見表2。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min 預(yù)變性；95 ℃10 s，60 ℃60 s，共循環(huán)40 次；每間隔1 ℃收集1次熒光信號(hào)，根據(jù)溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；每個(gè)樣本進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)，取3 次CT值平均值，采用2-ΔΔCT法，以ACTB 為內(nèi)參，計(jì)算hsa_circ_0006689的相對(duì)表達(dá)量。

表1 基因引物序列

表2 qPCR反應(yīng)體系

1.4 hsa_circ_0006689的耐酶消化特性

取一份上述RNA 平均分為2 份，分別加入RNsae R和等體積無酶水，反應(yīng)體系見表3，混勻后置于普通PCR儀中孵育，37 ℃，20 min，隨后將消化后的產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行qPCR檢測，具體步驟同前。以RNase R(-)組的CT 值為參照，計(jì)算RNase R(+)組circRNA及mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表3 RNsae R反應(yīng)體系

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

使用circBank（http://www.circbank.cn/）網(wǎng)站預(yù)測hsa_circ_0006689 可能結(jié)合的miRNA，篩選出可能結(jié)合的miRNA。將circ-0006689及其突變序列克隆至報(bào)告基因luciferase 下游構(gòu)建表達(dá)載體；培養(yǎng)293T 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至70%時(shí)，使用lipofectamine TM2000 將circ_0006689-Wt/Mut 與miRNA mimics 或陰性對(duì)照（NC）共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，培養(yǎng)48h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.6 hsa_circ_0006689的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

分別使用TargetScan（http://www.targetscan.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）網(wǎng)站來預(yù)測上述所得miRNA 可能靶向的mRNA，取能被兩個(gè)網(wǎng)站共同預(yù)測到的mRNA 進(jìn)行下一步分析。將交集所得的靶基因利用David v6.8（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn) 行GO（gene ontology）和KEGG pathway分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 8.0.2、Rstudio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖。首先將數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布則采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25～P75）]表示，兩樣本比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組hsa_circ_0006689相對(duì)表達(dá)量比較

觀察組PBMC 中hsa_circ_0006689 的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），見圖1。進(jìn)一步對(duì)觀察組中活動(dòng)組與非活動(dòng)組的hsa_circ_0006689 表達(dá)水平進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.3），見圖2。

圖1 兩組hsa_circ_0006689相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 觀察組中活動(dòng)組和非活動(dòng)組hsa_circ_0006689相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 hsa_circ_0006689可耐RNase R消化

經(jīng)RNase R消化處理后，hsa_circ_0006689的相對(duì)表達(dá)量有輕度升高，而作為mRNA的ACTB的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著降低，見圖3。表明hsa_circ_0006689具有較強(qiáng)的耐受RNase R酶消化的能力。

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

通過circBank（http://www.circbank.cn/）網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006689 可能靶向65個(gè)miRNA，見圖4。其中hsa-mir-1255a 堿基序列的種子區(qū)與hsa_circ_0006689存在2處結(jié)合位點(diǎn)，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果證實(shí)mir-1255a mimics可以顯著抑制circ_0006689-Wt 質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度（P＜0.05），而circ_0006689-Mut組質(zhì)粒的熒光強(qiáng)度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05)，表明hsa_circ_0006689 可以靶向結(jié)合hsa-mir-1255a，見圖6。

圖3 RNase R 處理后hsa_circ_0006689 與ACTB 相對(duì)表達(dá)量比較

圖4 hsa_circ_0006689-miRNA網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 hsa_circ_0006689、hsa-mir-1255a、circ_0006689-Mut 三者堿基結(jié)合位點(diǎn)

圖6 hsa_circ_0006689靶向結(jié)合hsa-mir-1255a

2.4 hsa-mir-1255a調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

將hsa-miR-1255a 輸入TargetScan、miRWalk 網(wǎng)站來預(yù)測可能的靶基因，選擇能被兩個(gè)網(wǎng)站共同預(yù)測到的靶基因，共獲得1 050 個(gè)靶基[9]；RNA-seq 中下調(diào)的基因共8 196個(gè)差異基因，將預(yù)測的1 050個(gè)靶基因與RNA-seq中的差異基因取交集得到525個(gè)基因，見圖7，將上述525 個(gè)基因輸入，將交集所得525 個(gè)靶基因利用David v6.8（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO和KEGG pathway分析。

圖7 hsa-mir-1255a靶基因與RNA-seq的交集

2.5 差異靶基因的GO分析

將上述525個(gè)靶基因進(jìn)行GO分析，分別從分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）3個(gè)方面分析這些基因功能的富集情況，探究hsa_circ_0006689 在SLE 中潛在的作用機(jī)制。MF的結(jié)果顯示，靶基因主要富集在metal ion binding、receptor activity、transcription factor activity、sequence-specific DNA binding、GTP binding retinoic acid receptor binding、transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity、SMAD binding GTPase activity、transcription factor binding 等分子功能中富集。CC 結(jié)果提示，靶基因主要分布在cytoplasmic vesicle、intracellular、endoplasmic reticulum lumen、cytoplasm、cell junction、plasma membrane、endoplasmic reticulum membrane、neuromuscular junction、cytosol 等細(xì)胞組分，主要富集在胞質(zhì)中。BP 結(jié)果提示主要在transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway、positive regulation of transcription,DNA-templated、signal transduction by protein phosphorylation、post-embryonic development、negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter、regulation of small GTPase mediated signal transduction、transcription,DNA-templated、positive regulation of mesenchymal cell proliferation、positive regulation of osteoblast different、activation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process等生物學(xué)過程，這些生物過程主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和蛋白質(zhì)磷酸化有關(guān)，見圖8。

2.6 靶基因的KEGG pathway分析

通過KEGG pathway 分析發(fā)現(xiàn)，靶基因富集在Signaling pathways regulating pluripotency of stem cells、TGF-beta signaling pathway、Hippo signaling pathway、ErbB signaling pathway、Cell adhesion molecules（CAMs）、Amphetamine addiction、Chronic myeloid leukemia 等信號(hào)通路中。主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，其中TGF-beta signaling pathway 為免疫相關(guān)通路，見圖9。

圖8 靶基因的GO富集結(jié)果

圖9 靶基因KEGG pathway富集結(jié)果

3 討論

環(huán)狀RNA是一種由反向剪接、共價(jià)連接而形成的閉環(huán)非編碼RNA，它缺少常規(guī)mRNA 的5’帽子結(jié)構(gòu)及3’poly A尾[10]，這個(gè)特點(diǎn)使得環(huán)狀RNA可以對(duì)耐受RNase R 的消化，其在組織中表達(dá)穩(wěn)定的特性，使其具有潛力成為SLE的生物標(biāo)記物。已經(jīng)有學(xué)者報(bào)道，SLE 合并腎損害患者外周血中has_circ_0082688、has_circ_0008675 水平升高，可作為診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物[11]。Guo 等[12]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000479 有可能成為診斷SLE 的一種新的生物標(biāo)志物。本研究中，筆者所選擇的hsa_circ_0006689 經(jīng)RNase R 消化處理后，線性結(jié)構(gòu)的ACTB mRNA 相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)顯著降低，而環(huán)狀RNAhsa_circ_0006689 的相對(duì)表達(dá)量則出現(xiàn)輕度升高，這種升高考慮為線性RNA被消化后、環(huán)狀RNA相對(duì)富集所致，該結(jié)果一方面說明了hsa_circ_0006689 具有耐受RNase R 酶消化的特性，另一方面也從側(cè)面印證了hsa_circ_0006689 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。此外，筆者也擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證了hsa_circ_0006689 在SLE 患者中的表達(dá)較正常人下降（P＜0.05），結(jié)合本課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006689 的表達(dá)與SLE 的活動(dòng)度具有相關(guān)性，表明hsa_circ_0006689 生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有成為SLE生物標(biāo)志物的巨大潛力。

目前已報(bào)道的環(huán)狀RNA 功能主要有：（1）作為miRNA的“海綿”；（2）充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的“海綿”，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的功能；（3）充當(dāng)支架來介導(dǎo)酶—底物復(fù)合物的形成并將蛋白質(zhì)募集到特定的位置；（4）不依賴帽的翻譯功能；（5）與線性剪接發(fā)生競爭，影響其宿主基因的表達(dá)[6]。在腫瘤、心血管疾病、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病中，環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)可以通過上述功能對(duì)這些疾病的發(fā)生發(fā)展起到調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，環(huán)狀RNA 可以影響SLE 的發(fā)生發(fā)展，其中環(huán)狀RNA 作為“miRNA 海綿”作用的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)，CircIBTK 在SLE 中表達(dá)下調(diào)，可能通過與miR-29b 結(jié)合來調(diào)節(jié)SLE 中DNA 去甲基化和AKT信號(hào)通路從而影響SLE的發(fā)生發(fā)展，并且可作為SLE 的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[13]。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0123190 可能通過海綿吸附hasmiR-483-3p 在狼瘡性腎炎中充當(dāng)ceRNA 來調(diào)節(jié)APLNR 的表達(dá)。Zhang 等[15]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0012919在SLE CD4+T 細(xì)胞下調(diào)，并且可以靶向結(jié)合miR-125a-3p 從而促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞中CD11a 和CD70 的DNA甲基化。

為進(jìn)一步探討hsa_circ_0006689 作用的分子機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0006689序列中存在兩個(gè)hsa-mir-1255a種子區(qū)的合位點(diǎn)，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了hsa_circ_0006689可以靶向結(jié)合hsa-miR-1255a。這一結(jié)果說明hsa_circ_0006689 可能通過與靶基因競爭性結(jié)合hsa-mir-1255a 從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。使用TargetScan、miRWalk 網(wǎng)站預(yù)測hsa-mir-1255a的靶基因，構(gòu)建hsa_circ_0006689-hsa-miR-1255amRNA 互作網(wǎng)絡(luò)，分析hsa_circ_0006689 可能的作用機(jī)制；通過預(yù)測共獲得525 個(gè)可能與hsa-miR-1255a 靶向結(jié)合的mRNA。對(duì)以上525 個(gè)靶基因進(jìn)行GO、KEGG pathway分析后發(fā)現(xiàn)部分靶基因富集在跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上，且與TGF-β 信號(hào)通路高度相關(guān)。目前多個(gè)研究表明TGF-β 信號(hào)通路、酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能通過影響免疫細(xì)胞的增殖、分化和激活而影響SLE 的發(fā)生發(fā)展[16]。研究報(bào)道，脾酪氨酸激酶（Sky）在SLE患者的T細(xì)胞中過表達(dá)，在免疫細(xì)胞中參與膜介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制Sky表達(dá)可以改善（NZB x NZW）狼瘡易感小鼠T細(xì)胞的功能，減緩皮膚及腎臟病變的發(fā)展[17]。酪氨酸激酶2的基因多態(tài)性與SLE相關(guān)[18]。

綜 上，hsa_circ_0006689 在SLE 患 者PBMC 中明顯下調(diào)，且生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以耐受RNase R酶的消化；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0006689 通過競爭性結(jié)合hsa-mir-1255a 從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，這些靶基因與跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及TGF-β 信號(hào)通路等免疫相關(guān)通路有關(guān)。我們有理由推測，hsa_circ_0006689 可能通過靶向結(jié)合hsa-mir-1255a 來調(diào)節(jié)跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及TGF-β 信號(hào)通路，從而影響了SLE 的發(fā)生發(fā)展，并且有潛力成為幫助SLE 診斷和評(píng)估病情的生物標(biāo)志物。