龐麗君 ，馮鐘文，陳思韻，黃瑀莘，龍 妍，黃權(quán)芳，林 興，韋錦斌△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023）

急性肝損傷在臨床上十分常見，可誘發(fā)急性肝損傷的危險因素有多種，如病毒、疾病及用藥不當(dāng)?shù)萚1-2]，具有預(yù)后不良及高死亡率等特性，嚴(yán)重危害人類生命健康。因此，迫切需要開發(fā)急性肝損傷的特效藥。脂多糖（LPS）聯(lián)合D-氨基半乳糖（D-Gal）腹腔注射是一種常用于研究藥物治療急性肝損傷潛在機制的經(jīng)典研究模型。LPS 具有很強的毒性，可以激活免疫系統(tǒng)并最終導(dǎo)致敗血癥經(jīng)常引起多器官衰竭，特別是肝損傷。此外，D-Gal作為LPS的增敏劑，可通過抑制多種RNA 的合成，增強肝臟內(nèi)LPS的肝毒性[3]。

香蜂草苷是一種黃酮類化合物，具有較強的抗炎和抗氧化的作用[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，香蜂草苷對四氯化碳（CCl4）所致的急性肝損傷具有良好的保護作用[5]。然而，目前關(guān)于香蜂草苷對LPS和D-Gal 引起的急性肝損傷的影響尚無相關(guān)報道。因此，本實驗通過LPS/D-Gal誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，研究香蜂草苷對小鼠急性肝損傷的保護作用及其作用機制，為急性肝損傷和其他急性炎癥性疾病的治療提供新的靶標(biāo)和潛在的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠90只，體重（20±2）g，購于湖南天勤生物技術(shù)有限公司（動物使用許可證號：SYXK 湘2014-0011），控制溫度（25±2）℃，相對濕度60%～70%，光照強度300 Lx，每日光照時間12 h。本研究中涉及小鼠的所有實驗均符合廣西醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與主要儀器 香蜂草苷，純度≥98%，批號：P13S9L70276，購于上海源葉生物科技有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸，批號：170610，購于北京協(xié)和藥廠；LPS（批號：813Q038，Solarbio）；D-Gal（批號：KT052019，BOMEI）；NF-κB p65、IKKα/β和p-IKKα/β 兔源單克隆抗體（美國CST 公司）；白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物研究所）；組織裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司）。7100型全自動血生化分析儀（日本Hitachi公司）；Nanodrop3000微量核酸蛋白分析儀（美國Thermo Fisher 公司）；CKX-41 倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；Western blotting 電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Red公司）；Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國LICOR公司）。

1.3 動物分組及造模 將90 只C57BL/6 小鼠隨機分為6組（n=15）：正常對照組、香蜂草苷對照組（0.8 mg/kg 香蜂草苷）、模型組、陽性對照組（175 mg/kg聯(lián)苯雙酯）及香蜂草苷低、高劑量組（0.4 mg/kg、0.8 mg/kg 香蜂草苷）。正常對照組和模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，其余各組灌胃給予相應(yīng)藥物，共14 d。預(yù)處理結(jié)束時，除正常對照組和香蜂草苷對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射D-Gal（800 mg/kg）和LPS（50 μg/kg）建立急性肝損傷模型[6]；4 h后，根據(jù)實驗要求進行進一步的操作。

1.4 樣本采集和處理 各組小鼠腹腔注射對應(yīng)藥物4 h 后，用乙醚麻醉并采用摘眼球取血法取新鮮血液于1.5 mL 離心管中，隨后頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出小鼠肝臟，血液靜置30 min 后離心20 min。采用4 ℃生理鹽水清洗肝臟表面后，用濾紙吸干表面液體并將其切成若干塊，分裝置于-80 ℃冰箱冷藏保存。

1.5 病理組織學(xué)檢查[7]用4%多聚甲醛固定肝組織，石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，行蘇木精－伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察肝臟病理改變。

1.6 生化指標(biāo)測定 采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性。

1.7 血清炎癥因子水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定L-1β、IL-6 和TNF-α 含量。酶標(biāo)儀檢測450 nm 波長處各孔光密度（OD）值，并根據(jù)說明書計算小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.8 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 稱取適量小鼠肝臟，按重量∶體積=1∶9的比例加入相應(yīng)體積的生理鹽水，在冰浴條件下對其進行勻漿，隨后組織勻漿于4 ℃下離心10 min，保留上清液。用BCA試劑盒對各組樣本的蛋白濃度進行定量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測小鼠肝臟SOD活性和MDA含量。

1.9 Western blotting 法檢測肝組 織p-IKKα/β、IKKα/β 及NF-κBp65 蛋白表達(dá) 取適量肝臟組織，剪碎，放入玻璃勻漿器中，加入RIPA緩沖溶劑，在冰上研磨。靜置10 min 后，4 ℃下離心20 min，取上清。BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定。7.5%～12.5%SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳90 min，采用濕轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，1 h后將PVDF膜取出，用TBST溶液搖床洗滌3次，10 min/次；封閉15 min，TBST 洗滌3 次，10 min/次；將PVDF 膜與相應(yīng)的一抗（均為1∶1 000）置于4 ℃冰箱孵育過夜，TBST洗滌3次，10 min/次；熒光二抗（1∶10 000）于室溫條件（25 ℃）下避光搖床孵育1 h，TBST 洗滌3 次，10 min/次。Odyssey 雙色紅外成像系統(tǒng)進行掃膜，Image J2軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠肝病理組織學(xué)變化的影響 HE 染色結(jié)果顯示，正常對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰可見，肝小葉以及肝細(xì)胞完整；模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的病理改變，包括水腫或充血，肝細(xì)胞壞死，肝組織結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細(xì)胞浸潤，中央靜脈不規(guī)則擴張；與模型組相比，香蜂草苷低、高劑量組肝組織病理形態(tài)學(xué)改變較模型組均有明顯改善，且香蜂草苷高劑量組改善更明顯，見圖1。

圖1 HE染色觀察小鼠肝臟組織學(xué)變化（×400）

2.2 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響 與正常對照組相比，模型組血清AST和ALT 活性明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，香蜂草苷低、高劑量組血清ALT、AST活性均降低，且香蜂草苷高劑量組低于香蜂草苷低劑量組（P＜0.05），見表1。

2.3 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平的影響 與正常對照組比較，模型組血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）；香蜂草苷低、高劑量組血清IL-1β、IL-6 及TNF-α 水平均低于模型組，且香蜂草苷高劑量組TNF-α含量低于香蜂草苷低劑量組（P＜0.05），見表2。

表1 香蜂草苷預(yù)處理后小鼠血清ALT和AST活性變化 n=15，

表1 香蜂草苷預(yù)處理后小鼠血清ALT和AST活性變化 n=15，

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香蜂草苷高劑量組比較，△P＜0.05。

表2 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平變化 n=15，

表2 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平變化 n=15，

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香蜂草苷高劑量比較，△P＜0.05。

2.4 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠血清中SOD 活性和MDA 含量變化的影響 與正常對照組比較，模型組血清SOD 活性顯著降低，而MDA 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，香蜂草苷低、高劑量組血清MDA含量顯著降低，SOD活性顯著升高，且香蜂草苷高劑量組改善更明顯（P＜0.05），見表3。

表3 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響 n=15，

表3 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響 n=15，

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香蜂草苷高劑量組比較，△P＜0.05。

2.5 香蜂草苷對急性肝損傷小鼠肝組織p-IKKα/β及NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型組NF-κB p65、p-IKKα/β蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；經(jīng)香蜂草苷預(yù)處理后，香蜂草苷低、高劑量組NF-κB p65、p-IKKα/β蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，且香蜂草苷高劑量組NF-κB p65蛋白表達(dá)量低于香蜂草苷低劑量組（P＜0.05），見圖2、表4。

圖2 香蜂草苷對小鼠肝臟中P-IKKα/β、IKKα/β及NF-κB蛋白表達(dá)的影響

表4 香蜂草苷對小鼠肝臟p-IKKα/β 及NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 n=15，

表4 香蜂草苷對小鼠肝臟p-IKKα/β 及NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 n=15，

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與香蜂草苷高劑量組比較，△P＜0.05。

3 討論

LPS 作為一種強大的炎癥因子，可激活免疫細(xì)胞，使其分泌促炎因子，導(dǎo)致炎癥性肝損傷[8-9]。此外，D-Gal是一種特異性的LPS致敏劑，導(dǎo)致三磷酸尿苷（UTP）大量耗損，同時抑制RNA 的合成[10-11]。正常情況下，AST 和ALT 主要存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝臟受到一些有害因素的刺激時，許多肝細(xì)胞被破壞后，繼而將AST 和ALT 釋放到血液中，導(dǎo)致血清中AST和ALT水平顯著升高[12]。因此，血清ALT和AST水平可作為肝細(xì)胞損傷的標(biāo)志，用來評估肝損傷的嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組ALT和AST活性顯著升高（P＜0.05），且HE 染色結(jié)果顯示肝組織出現(xiàn)嚴(yán)重的病理改變：肝組織結(jié)構(gòu)被破壞，炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞壞死，提示急性肝損傷模型復(fù)制成功；與模型組比較，香蜂草苷低、高劑量組ALT 和AST 活性顯著降低，高劑量組效果最優(yōu)（P＜0.05）；病理組織檢查結(jié)果顯示，經(jīng)香蜂草苷預(yù)處理后，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損壞、充血、壞死等現(xiàn)象均得到明顯改善，且高劑量組的治療效果明顯優(yōu)于低劑量組。以上結(jié)果提示香蜂草苷對LPS/D-Gal誘導(dǎo)的急性肝損傷有一定的保護作用，且高劑量香蜂草苷效果更好。

研究表明，急性肝損傷的發(fā)病機制復(fù)雜多變，但氧化應(yīng)激始終扮演著十分重要的角色。在LPS/D-Gal 誘導(dǎo)的急性肝損傷中，機體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的失衡導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化損傷[13]。SOD 作為一種抗氧化酶，促進氧化－抗氧化劑的平衡。SOD可催化超氧化物歧化產(chǎn)生過氧化氫，防止氧中毒。另一方面，MDA 在肝臟脂質(zhì)過氧化起到十分重要的作用。這兩種物質(zhì)在體內(nèi)的異常變化可能會使氧化應(yīng)激加劇，從而導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡[14]。本研究中，模型組小鼠SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）。而香蜂草苷預(yù)處理可提高SOD 的活性，同時降低MDA 含量（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，香蜂草苷可增加肝細(xì)胞的抗氧化能力，減少氧化損傷，最終保護LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝損傷。

研究表明，炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致LPS/Gal 引起肝損傷的主要因素。而IL-1β、IL-6和TNF-α在與炎癥反應(yīng)中扮演著重要的角色。決定了急性肝損傷的發(fā)生及病程的發(fā)展[15]。實驗結(jié)果表明，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平顯著升高（P＜0.05），經(jīng)香蜂草苷預(yù)處理后，IL-1β、IL-6和TNF-α的異常升高現(xiàn)象得到明顯改善（P＜0.05），且高劑量組改善程度較低劑量組更優(yōu)。以上結(jié)果提示香蜂草苷可能通過抑制小鼠肝臟炎癥反應(yīng)，從而起到治療LPS/D-Gal所引起的急性肝損傷的作用。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，活化后的NF-κB可促進多種炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄及分泌，繼而參與生理和病理過程的調(diào)節(jié)[16]。本研究表明，模型組NF-κB p65、p-IKKα/β 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），經(jīng)香蜂草苷預(yù)處理后，NF-κB p65、p-IKKα/β表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），且香蜂草苷高劑量效果更優(yōu)。提示香蜂草苷減輕炎癥因子的過度釋放，可能與抑制NF-κB信號通路有關(guān)。

綜上，香蜂草苷能減輕LPS/D-Gal 誘導(dǎo)的急性肝損傷，其機制可能與抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及NF-κB信號通路的激活有關(guān)，本研究為香蜂草苷作為一種治療急性肝損傷的新藥提供了實驗依據(jù)。