程速遠(yuǎn)，劉志磊，郭舒楊，任慧梅，梁爭論，胡忠玉，何鵬，李敏

1.國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100038；2.中國食品藥品檢定研究院，北京102629

目前，新型冠狀病毒（SARS-Cov-2）仍在全球大規(guī)模流行，由于其傳播速度快，發(fā)病率高，已對全球超過3 211 萬人產(chǎn)生影響，成為一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題［1-3］。多個(gè)國家或地區(qū)的企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)正在積極進(jìn)行新型冠狀病毒疫苗（簡稱新冠疫苗）的研發(fā)，根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，目前全球在研新冠疫苗超過160 個(gè)，已有10 種疫苗進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)階段，分別有2 種和21 種進(jìn)入臨床Ⅱ期和Ⅰ期試驗(yàn)階段。國內(nèi)現(xiàn)有5 條技術(shù)路線的多種新冠疫苗也在同步快速推進(jìn)。

新冠重組疫苗通常采用CHO 細(xì)胞等表達(dá)的新冠病毒的S 蛋白表面受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（rece-ptorbinding domain，RBD）抗原，經(jīng)純化后，加入佐劑制成。本文就新冠重組疫苗質(zhì)量控制和技術(shù)評價(jià)要點(diǎn)進(jìn)行歸納，強(qiáng)調(diào)生產(chǎn)過程的一致性，并參考目前達(dá)成的階段性共識，闡述審評的關(guān)注和考量，以期為5 條技術(shù)路線之一的新冠重組疫苗藥學(xué)研發(fā)提供參考。

1 一般考慮

臨床試驗(yàn)用樣品應(yīng)在符合GMP 的條件下生產(chǎn)。其藥物研發(fā)原則上應(yīng)遵循新冠疫苗系列技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）、《中國藥典》以及 WHO、ICH 等國際組織有關(guān)技術(shù)要求，并根據(jù)其作用機(jī)制、遞呈方式和免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)等核心要點(diǎn)，開展相關(guān)研究工作。

動(dòng)物試驗(yàn)表明，雖然SARS 候選疫苗誘導(dǎo)的中和抗體具有一定的保護(hù)作用，但由于細(xì)胞免疫在病毒和感染細(xì)胞的清除中起至關(guān)重要的作用，為實(shí)現(xiàn)長效保護(hù)機(jī)制，新冠疫苗設(shè)計(jì)需同時(shí)考慮體液免疫和細(xì)胞免疫［4］。此外，由于呼吸道和接觸是新冠病毒主要的傳播途徑，黏膜免疫在防止病毒感染中的作用也不容忽視。新冠病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包括4 部分：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。S 蛋白通過RBD 與細(xì)胞表面受體ACE2特異性結(jié)合后感染細(xì)胞，與S 蛋白或RBD 結(jié)合的中和抗體可通過阻遏新冠病毒與細(xì)胞的結(jié)合從而防止病毒感染；同時(shí)，S 蛋白還能有效刺激T 細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，因此，S 蛋白或RBD 通常作為疫苗研發(fā)中最關(guān)鍵的目標(biāo)抗原。此外，N 蛋白和M 蛋白也被證明可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫反應(yīng)［5］。

1.1 目的基因和分子設(shè)計(jì) 建議目的基因選擇新冠病毒保護(hù)性抗原的基因序列，按照重組蛋白的技術(shù)要求構(gòu)建重組蛋白疫苗的生產(chǎn)用工程菌毒株。應(yīng)充分考慮目的蛋白與野生新冠病毒結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾上的一致性。新冠病毒的S 蛋白RBD 的幾個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基與ACE2 之間存在重要的相互作用，因此，新冠重組蛋白疫苗通常采用RBD 作為免疫原。根據(jù)目前的研究進(jìn)展，ACE2 被認(rèn)為是阻斷新冠病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞治療冠狀病毒感染的關(guān)鍵宿主靶點(diǎn)。

建議重點(diǎn)關(guān)注新冠病毒基因序列的來源、流行株的代表性，考慮所選目的基因?qū)Π踩裕廴鐚σ呙缈贵w依賴性增強(qiáng)（antibody dependent enhancement，ADE）效應(yīng)、肺部免疫病理反應(yīng)等的潛在影響］、免疫原性（如抗原表位分析、不同毒株之間的交叉保護(hù)作用等）、抗原表達(dá)（如天然多聚體 ／ VLP 形成等）以及病毒抗原完整性等方面的影響，可結(jié)合必要、適用的細(xì)胞水平病毒中和試驗(yàn)、抗原譜或表位分析試驗(yàn)開展研究。

由于天然的RBD 序列為糖基化修飾蛋白，建議盡量選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞系作為宿主細(xì)胞。翻譯后修飾通常影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，糖基化作為一種重要的翻譯后修飾形式，參與蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸、定位、受體激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種關(guān)鍵的生物學(xué)活性，且影響蛋白穩(wěn)定性、藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性等。因此，糖蛋白功能的發(fā)揮，不僅依賴蛋白的正確表達(dá)及其高級結(jié)構(gòu)的形成，糖基化的正確修飾也具有同等重要的作用。因此，糖基化修飾既是完整的生物學(xué)活性所必須，也是生產(chǎn)工藝過程研究和質(zhì)控的重點(diǎn)［6］。由于大腸埃希菌是原核生物，表達(dá)的蛋白無糖基化修飾，生物學(xué)活性會(huì)受較大影響，應(yīng)慎重考慮采用大腸埃希菌作為宿主細(xì)胞。

2020 年3 月，美國佐治亞大學(xué)在Emerging Microbes & Infections 雜志上發(fā)表論文［7］：采用 293 細(xì)胞分別表達(dá)新冠病毒S 蛋白的S1 和S2 亞基，蛋白酶切后通過質(zhì)譜法進(jìn)行糖譜解析到22 個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，其中17 個(gè)有糖基化修飾，剩余5 個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)糖基化修飾。糖基化修飾主要為高甘露糖型和復(fù)合型，不存在雜合型。此外，還從S1 蛋白的 RBD 區(qū)域鑒定出 2 個(gè) O-糖基化位點(diǎn)（O323 ／ O325）。另外，英國南安普頓大學(xué)和美國德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校在bioRxiv 發(fā)表論文［8］：采用293F 細(xì)胞重組蛋白表達(dá)新冠病毒S 蛋白，蛋白酶切后通過質(zhì)譜法鑒定出S 蛋白上22 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，其中18 個(gè)為保守位點(diǎn)，并采用冷凍電鏡在3D結(jié)構(gòu)繪制了S 蛋白三聚體糖蛋白圖譜，揭示了N-連接多糖是如何遮蔽S 蛋白表面不同區(qū)域的?？紤]到受體結(jié)合位點(diǎn)的功能性限制和這些殘基的低突變率，作者猜測，可能病毒利用N-連接多糖來遮蔽最保守和易受攻擊的區(qū)域。中國四川大學(xué)華西醫(yī)院在bioRxiv 發(fā)表論文［9］：對市售新冠 S 蛋白（昆蟲細(xì)胞表達(dá)）和S1 蛋白（293 細(xì)胞表達(dá)）的位點(diǎn)特異性N-糖基化進(jìn)行特征分析，也是采用酶切后質(zhì)譜分析方法，昆蟲細(xì)胞表達(dá)的S 蛋白共鑒定出22 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，主要為高甘露糖型修飾，共含有38 種多糖；而293 細(xì)胞表達(dá)的S1 蛋白主要為復(fù)合型糖基化修飾，共含有140 種多糖。提示采用昆蟲細(xì)胞和293 細(xì)胞表達(dá)的S 蛋白，其糖鏈修飾類型和多糖組成差異較大。上述3 篇論文均通過質(zhì)譜法對體外重組表達(dá)的新冠病毒S 蛋白的糖基化位點(diǎn)和糖鏈類型進(jìn)行了全面分析，由于不同表達(dá)體系細(xì)胞的翻譯后修飾系統(tǒng)不同，導(dǎo)致表達(dá)的S 蛋白的糖基化水平和糖型種類有很大不同。而在上述3 篇論文中，同樣采用293 細(xì)胞表達(dá)的S 蛋白的糖基化修飾和多糖組成也存在明顯差異，表明重組S 蛋白的糖基化修飾具有多樣性和異質(zhì)性，應(yīng)引起新冠藥物及疫苗研發(fā)企業(yè)的重視。

基于目前的研究對新冠病毒的認(rèn)識尚不全面，建議研發(fā)者密切跟蹤新冠病毒結(jié)構(gòu)和活性方面的基礎(chǔ)研究，選擇合適的分子結(jié)構(gòu)作為抗原，關(guān)注糖基化修飾和高級結(jié)構(gòu)，以獲得較好的疫苗免疫效果。

1.2 臨床前及臨床期間工藝變更 藥學(xué)變更貫穿于藥品研發(fā)的各階段，特別是研發(fā)早期。開展臨床前藥理毒理研究及臨床試驗(yàn)研究的樣品建議采用工藝代表性（生產(chǎn)用原材料、生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)場地、生產(chǎn)規(guī)模、制劑處方、包材等）批次。建議在早期臨床階段，即建立與產(chǎn)品安全性相關(guān)的包括工藝參數(shù)和可接受標(biāo)準(zhǔn)的過程控制；為了積累產(chǎn)品及工藝知識，在早期應(yīng)建立盡可能多的過程控制指標(biāo)，為變更前后質(zhì)量可比性研究及可能出現(xiàn)問題的評價(jià)積累數(shù)據(jù)，待積累足夠數(shù)據(jù)并充分驗(yàn)證后再考慮適度減少控制指標(biāo)。建議在關(guān)鍵臨床試驗(yàn)階段采用與擬上市生產(chǎn)規(guī)模相當(dāng)?shù)纳a(chǎn)工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

臨床試驗(yàn)期間常見的變更包括生產(chǎn)規(guī)模放大和工藝優(yōu)化等，為評估變更對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，應(yīng)開展充分的質(zhì)量可比性研究，包括但不限于結(jié)構(gòu)表征、批分析、穩(wěn)定性、可比性研究等。可比性研究應(yīng)進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，包括納入可比性研究的批次、比對研究項(xiàng)目、可比性驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)等，還應(yīng)關(guān)注研發(fā)各階段代表性批次的留樣問題。如質(zhì)量可比性研究結(jié)果不能充分說明變更未產(chǎn)生不利影響，可能需要提供額外的非臨床研究、甚至臨床研究資料進(jìn)行橋接，如免疫原性比較和必要的安全性比較等。鑒于新冠疫苗的復(fù)雜性及目前認(rèn)知的有限性，對于臨床期間的重大變更，建議開展變更前后細(xì)胞免疫、體液免疫等全面的效力研究的比較分析。

2 藥學(xué)關(guān)注要點(diǎn)

2.1 生產(chǎn)用原材料 由于生物制品生產(chǎn)用原材料來源較復(fù)雜，存在引入外源因子的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)對生產(chǎn)用原材料進(jìn)行嚴(yán)格的來源分析和質(zhì)量控制。重組疫苗生產(chǎn)用原材料在此基礎(chǔ)上，尤其需關(guān)注生產(chǎn)過程中所用的動(dòng)物源性材料，并評估其安全性風(fēng)險(xiǎn)，包括引入外源因子的風(fēng)險(xiǎn)。鼓勵(lì)采用符合各國藥典要求或已用于上市產(chǎn)品的原材料。

生產(chǎn)用原材料應(yīng)符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定或與國際通行要求一致。對于生產(chǎn)中所用的關(guān)鍵原材料，包括蛋白水解酶、親和抗體、化學(xué)修飾物等，若為外購產(chǎn)品，應(yīng)明確質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行嚴(yán)格的供應(yīng)商審計(jì)；若為自行生產(chǎn)，則應(yīng)在申報(bào)資料中提供生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性等研究內(nèi)容，并關(guān)注批間一致性。若使用一次性發(fā)酵袋／ 儲(chǔ)液袋、濾膜／濾器、層析柱填料等，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性評估，其質(zhì)量應(yīng)符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定，或與國際通行要求一致。

2.2 上游構(gòu)建和毒種庫建立 宿主細(xì)胞應(yīng)來源清晰、可溯源，應(yīng)提供生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)的來源、可用于生產(chǎn)的研究資料或證明文件、歷史（包括建立細(xì)胞系、鑒定和傳代等）。應(yīng)進(jìn)行全面檢定，特別是生物學(xué)特性、核型分析、外源因子檢查、成瘤性和 ／ 或致瘤性檢查等，并提供相應(yīng)檢定結(jié)果。如使用已用于其他上市疫苗的細(xì)胞基質(zhì)，可簡化提供相應(yīng)的證明性材料或只提供承諾說明。

工程細(xì)胞株構(gòu)建過程應(yīng)清晰，需說明傳代、基因操作方式，克隆篩選及鑒定、檢定情況，構(gòu)建過程中應(yīng)篩選目的基因完全正確的細(xì)胞株，重組蛋白疫苗應(yīng)與主要流行毒株和 ／ 或假毒株在誘導(dǎo)中和抗體方面具有可比性。通常采用蛋白表達(dá)量高且穩(wěn)定性好的克隆作為疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞，建立三級細(xì)胞庫。應(yīng)說明各級細(xì)胞庫傳代方法、制備過程、建庫規(guī)模、限傳代次和儲(chǔ)存條件。應(yīng)明確主細(xì)胞庫和工作細(xì)胞庫的代次，按照《中國藥典》規(guī)定進(jìn)行鑒別試驗(yàn)、無菌檢查、遺傳穩(wěn)定性、抗原表達(dá)水平和免疫原性等檢定。提供各級細(xì)胞庫（包括生產(chǎn)終末細(xì)胞）的檢定報(bào)告，檢定項(xiàng)目包括外源因子檢測、鑒別試驗(yàn)、特性和型別、感染性滴度、抗原性、免疫原性及保護(hù)性抗原的完整性等；主細(xì)胞庫還須進(jìn)行基因序列測定。細(xì)胞庫系統(tǒng)的建立、檢定等需滿足《中國藥典》要求。在應(yīng)急狀態(tài)下，至少建立一級生產(chǎn)用細(xì)胞并完成全面檢定；對于細(xì)胞庫免疫原性檢測項(xiàng)目可結(jié)合藥效學(xué)研究開展，建立初步的標(biāo)準(zhǔn)，在臨床期間逐步完善。

確定限定代次的研究資料；檢定項(xiàng)目除參考細(xì)胞庫檢定項(xiàng)目外，還需進(jìn)行基因測序考察，鼓勵(lì)采用先進(jìn)的技術(shù)方法對傳代過程中目標(biāo)成分基因序列及目的產(chǎn)物質(zhì)量特性進(jìn)行考察。在應(yīng)急狀態(tài)下，為鼓勵(lì)疫苗研發(fā)，該部分可采用模擬傳代方式開展相關(guān)研究，在適當(dāng)傳代代次進(jìn)行有代表性的試驗(yàn)，應(yīng)能支持臨床樣品的生產(chǎn)。

2.3 生產(chǎn)工藝 臨床樣品制備工藝應(yīng)具備一定規(guī)模，具有一定的生產(chǎn)連續(xù)性和放大可行性。需提供初步的工藝確認(rèn)資料；提供工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)去除效果等初步研究資料。

應(yīng)提供生產(chǎn)工藝相關(guān)資料，包括工藝流程、關(guān)鍵步驟的工藝參數(shù)及控制范圍。為保證產(chǎn)品安全性，應(yīng)關(guān)注發(fā)酵培養(yǎng)中的污染控制情況及相關(guān)檢測結(jié)果，需提供初步的未處理收獲液或生產(chǎn)終末細(xì)胞外源因子檢定報(bào)告。申請人應(yīng)關(guān)注實(shí)際的病毒去除／滅活工藝，通常每個(gè)步驟的病毒清除能力應(yīng)至少由兩次獨(dú)立的研究加以重復(fù)驗(yàn)證。應(yīng)明確病毒去除 ／滅活驗(yàn)證過程中驗(yàn)證樣品的具體參數(shù)，包括蛋白含量、pH、過濾壓力差、過濾量等，病毒去除 ／ 滅活驗(yàn)證結(jié)果應(yīng)支持臨床使用批次的病毒安全性。

工藝研究可在平臺先驗(yàn)工藝經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行，但需有本品的研究和驗(yàn)證數(shù)據(jù)。如有研究簡化，需提供充分理由。

應(yīng)明確制劑處方中每種組分的作用及含量，提供佐劑、緩沖液、鹽濃度、pH 以及其他輔料的選擇依據(jù)；如使用特殊的抗原遞呈系統(tǒng)，如脂質(zhì)體、聚合物微粒等，應(yīng)至少提供遞呈系統(tǒng)所用組分的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、遞呈系統(tǒng)組分含量的選擇依據(jù)等。應(yīng)通過不同制劑處方對抗原-佐劑 ／ 遞呈系統(tǒng)相互作用（如吸附率、包封率、包封粒徑等）、動(dòng)物藥效學(xué)研究（免疫原性、保護(hù)力研究）、毒理研究、生產(chǎn)工藝可控性等方面的影響進(jìn)行篩選并確定初步的處方。

對于國內(nèi)外已上市產(chǎn)品中從未使用過的全新輔料，應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)申報(bào)。

應(yīng)提供輔料、佐劑來源及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)資料。應(yīng)急條件下，建議采用符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)的輔料。研究資料（包括研究方法、研究結(jié)果和研究結(jié)論）應(yīng)說明制劑工藝關(guān)鍵步驟確定的合理性以及工藝參數(shù)控制范圍的合理性，包括主要工藝參數(shù)研究資料，生產(chǎn)工藝參數(shù)對產(chǎn)品質(zhì)量屬性的影響等研究資料。

如產(chǎn)品使用佐劑，應(yīng)按照原液申報(bào)格式提供原材料、生產(chǎn)、特性鑒定、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性的研究資料。

由于應(yīng)急狀態(tài)下對病原體知識積累有限，且研發(fā)早期批次和數(shù)據(jù)少，鼓勵(lì)盡量積累過程控制指標(biāo)相關(guān)的產(chǎn)品知識和工藝知識，為工藝放大或工藝優(yōu)化后的可比性研究及可能存在的問題奠定基礎(chǔ)。研發(fā)初期，應(yīng)至少提供可支持開展臨床試驗(yàn)用疫苗的制備工藝控制要求，關(guān)注生產(chǎn)工藝的批間一致性。

2.4 質(zhì)量研究

應(yīng)對藥理毒理批次和 ／ 或臨床樣品批次等代表性批次樣品進(jìn)行全面的、與研究階段相適應(yīng)的特性分析和質(zhì)量研究。提供常規(guī)放行檢驗(yàn)分析及采用先進(jìn)、靈敏的分析技術(shù)進(jìn)行的質(zhì)量研究和特性研究數(shù)據(jù)。

特性研究通常包括結(jié)構(gòu)確證、生物學(xué)活性（結(jié)合及中和活性）、免疫學(xué)特性、純度（分子大小及電荷異構(gòu)體）和雜質(zhì)（工藝及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)）、體內(nèi)外效力、免疫學(xué)特性等研究。研發(fā)早期階段，建議提交初步的結(jié)構(gòu)確證研究數(shù)據(jù)，可在上市申報(bào)時(shí)提交完整的結(jié)構(gòu)確證資料。疫苗的生物效價(jià)研究是反應(yīng)工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量的綜合指標(biāo)，建議盡早開展相關(guān)研究。

2.4.1 結(jié)構(gòu)表征分析 提供常規(guī)放行檢驗(yàn)分析及采用先進(jìn)的分析技術(shù)進(jìn)行的質(zhì)量研究和特性分析研究數(shù)據(jù)。特性分析通常包括結(jié)構(gòu)特征、純度、雜質(zhì)分析（工藝相關(guān)雜質(zhì)及產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)）、體內(nèi)外效力、免疫學(xué)特性等研究。除常規(guī)放行檢驗(yàn)項(xiàng)目外，鼓勵(lì)對影響疫苗效力或安全性的其他結(jié)構(gòu)特征開展研究。糖基化可能影響免疫原性，鼓勵(lì)進(jìn)行相關(guān)研究，若不能排除糖基化對疫苗效力的影響，需在方法學(xué)研究到一定程度并積累數(shù)據(jù)后，將糖基化相關(guān)檢查納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

重組疫苗除參照重組治療用生物制品要求提供適用的相應(yīng)資料外，對于形成病毒樣顆粒的疫苗，還應(yīng)提供病毒樣顆粒關(guān)鍵結(jié)構(gòu)研究的相關(guān)資料。如是純化的抗原肽或具有保護(hù)性特點(diǎn)的表位肽，應(yīng)提供必要的正確性鑒定研究結(jié)果。

如涉及佐劑或新型抗原呈遞系統(tǒng)，應(yīng)結(jié)合其與抗原相互作用的結(jié)構(gòu)或特性開展必要的質(zhì)量研究，理化結(jié)構(gòu)特性如佐劑等電點(diǎn)、粒徑及其分布、與抗原的吸附鋁等；脂質(zhì)體包封率、粒徑等；生物學(xué)活性如佐劑或新的抗原遞呈系統(tǒng)對抗原的呈遞效果、降低佐劑或抗原毒性和／ 或增強(qiáng)抗原免疫反應(yīng)的相關(guān)研究等。

2.4.2 純度和雜質(zhì) 應(yīng)采用多種檢測方法（檢測原理不同）聯(lián)合檢測分析供試品純度，檢定結(jié)果應(yīng)不低于同類產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。

雜質(zhì)指生產(chǎn)工藝、貯存、和／ 或用于保存原液的密封容器中產(chǎn)生的、和 ／ 或穩(wěn)定性研究批次中發(fā)現(xiàn)的潛在雜質(zhì)，包括工藝相關(guān)雜質(zhì)和疫苗的降解雜質(zhì)。對于早期臨床試驗(yàn)申請，可根據(jù)來源、風(fēng)險(xiǎn)及殘留量的安全性水平等，列出潛在的雜質(zhì)及當(dāng)前擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（建議結(jié)合毒理試驗(yàn)結(jié)果、文獻(xiàn)資料、既往積累的認(rèn)知信息等綜合考慮）。對于開發(fā)后期臨床試驗(yàn)，除了早期臨床試驗(yàn)申請?zhí)峁┑男畔⒅猓€需進(jìn)一步進(jìn)行雜質(zhì)的分離、鑒別、對生物活性影響的分析，并關(guān)注檢測方法的方法學(xué)驗(yàn)證?？紤]其在生產(chǎn)和貯存期間是否顯著增加及其與疫苗有效性的相關(guān)性，確定是否納入過程控制或放行標(biāo)準(zhǔn)；對于需納入質(zhì)控體系的項(xiàng)目應(yīng)隨研究的逐步推進(jìn)加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)要求，如通過工藝驗(yàn)證可有效清除，可結(jié)合工藝進(jìn)行控制。

2.4.3 生物效價(jià) 與常規(guī)疫苗研發(fā)相似，重組疫苗也需進(jìn)行體內(nèi)效力、體外效力及動(dòng)物保護(hù)的研究。

體內(nèi)效力試驗(yàn)首選的方法為中和抗體檢測方法。此外，還可采用測定小鼠ED50的方法。應(yīng)選擇適宜的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系，建立檢測動(dòng)物血清中和抗體或總抗體的方法，包括中和試驗(yàn)毒株、包被抗原、參比品的研究等。如有必要和可能，鼓勵(lì)建立抗體性質(zhì)的評價(jià)方法，如亞型測定、針對抗原中和位點(diǎn)的分析等。

體外效價(jià)檢測一般是對疫苗抗原含量的檢測，需建立疫苗抗原含量的檢測方法，包括制備檢測用參比品等，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)是最理想的臨床前有效性評價(jià)及質(zhì)量控制手段之一，可結(jié)合藥效學(xué)研究開展。由于對病原體認(rèn)知有限及不同種類疫苗免疫機(jī)制不盡相同，鼓勵(lì)對細(xì)胞免疫水平的生物學(xué)活性開展相關(guān)研究。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中需納入針對新冠病毒的體內(nèi)效力指標(biāo)。如能建立有效的佐劑解離方法，建議在此基礎(chǔ)上建立抗原含量檢測作為體外效力測定方法。

2.4.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括檢查項(xiàng)目、檢查方法及標(biāo)準(zhǔn)限度，通常以列表形式提供。建議明確質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的擬定依據(jù)，包括是否符合我國或國際通用的有關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則、各國現(xiàn)行版藥典的要求等，說明設(shè)定各檢查項(xiàng)目和各項(xiàng)檢查方法選擇的考慮，根據(jù)臨床前藥理毒理批檢驗(yàn)結(jié)果、初步的工藝知識、穩(wěn)定性等研究結(jié)果，評估質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度范圍設(shè)置的合理性。

重組新冠疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括鑒別、純度（兩種機(jī)理的方法）、雜質(zhì)、體內(nèi)效力等。

申報(bào)臨床時(shí)提供的方法學(xué)驗(yàn)證資料應(yīng)能初步證實(shí)檢測方法的適用性，對重要指標(biāo)或關(guān)鍵質(zhì)量屬性（如保護(hù)效力、抗原量、免疫原性、滅活試驗(yàn)等）的檢測方法，應(yīng)提供與研發(fā)階段的控制及重要性相符或適用的驗(yàn)證資料；上市階段應(yīng)按照相關(guān)指導(dǎo)原則提供全面的方法學(xué)驗(yàn)證資料。

應(yīng)提供建立的參考品或?qū)φ掌穪碓?、制備、檢定結(jié)果、標(biāo)定過程及穩(wěn)定性研究（定期復(fù)檢）等方面的初步研究資料。

2.4.5 參比品研究 應(yīng)積累不同研究階段參比品的詳細(xì)信息，包括但不限于批次來源、制備工藝、檢驗(yàn)結(jié)果、標(biāo)定方法和結(jié)果、儲(chǔ)存條件和復(fù)驗(yàn)期等，應(yīng)關(guān)注參比品的代表性及可溯源性。此外，為確保產(chǎn)品質(zhì)量的可溯源性，建議對關(guān)鍵質(zhì)量屬性生物活性和純度等的參比品開展全面研究。

2.5 初步穩(wěn)定性研究 通常穩(wěn)定性研究方案設(shè)計(jì)應(yīng)遵循生物制品穩(wěn)定性指導(dǎo)原則［10］。臨床申報(bào)階段應(yīng)提供能夠支持臨床試驗(yàn)開展的穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)。應(yīng)關(guān)注關(guān)鍵項(xiàng)目的代表性圖譜、降解途徑和變化趨勢等。

應(yīng)急情況下，若考慮減少批次，需提供充分的支持依據(jù)。實(shí)驗(yàn)條件及持續(xù)時(shí)間需能夠支持臨床試驗(yàn)的開展，后續(xù)繼續(xù)完成本批次以及其他批次的穩(wěn)定性研究，進(jìn)行滾動(dòng)提交穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)，若有異常，需及時(shí)上報(bào)。

建議將新冠疫苗的體內(nèi)效力指標(biāo)作為關(guān)鍵指標(biāo)納入穩(wěn)定性研究的考察指標(biāo)，待積累產(chǎn)品開發(fā)各階段的多批次數(shù)據(jù)后，再結(jié)合體內(nèi)效力的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)綜合考慮完善后續(xù)穩(wěn)定性研究。

2.6 包裝系統(tǒng)及包材相容性 應(yīng)明確包材來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等信息，鼓勵(lì)采用已批準(zhǔn)或已用于上市產(chǎn)品生產(chǎn)的包材、容器。

若涉及特殊給藥裝置，如無針注射器、霧化器、鼻噴裝置等，需提交相關(guān)研究資料。如有可替代或支持性的其他研究資料，應(yīng)提交說明。

對于使用霧化給藥或鼻噴給藥的品種，應(yīng)結(jié)合擬使用的給藥裝置，參照《中國藥典》吸入劑或鼻用制劑和噴霧劑各項(xiàng)規(guī)定開展研究，并提供相關(guān)研究資料，并進(jìn)行臨床使用中穩(wěn)定性等研究。

包裝容器的選擇，應(yīng)關(guān)注與藥品接觸的內(nèi)包材對藥品的保護(hù)性和相容性，如容器內(nèi)表面可吸附蛋白、膠塞可能產(chǎn)生微粒、玻璃包材會(huì)發(fā)生玻璃脫片等問題，可在臨床試驗(yàn)期間按照相關(guān)法規(guī)和指導(dǎo)原則的要求規(guī)范開展完善的包材相容性研究。

2.7 制造和檢定記錄 應(yīng)提供確定用于臨床試驗(yàn)的工藝、規(guī)模及生產(chǎn)線生產(chǎn)的樣品制造和檢定記錄。盡可能包括詳細(xì)的制備控制技術(shù)條件和參數(shù)，便于溯源、事后分析改進(jìn)、充實(shí)、完善相應(yīng)的控制要求。

原則上，申報(bào)臨床試驗(yàn)應(yīng)提供能代表臨床樣品工藝的3 批產(chǎn)品的制造和檢定記錄，且批量需滿足臨床試驗(yàn)需求。應(yīng)急情況下若考慮減少批次，需提供充分的支持依據(jù)，如已有早期數(shù)據(jù)或平臺先驗(yàn)工藝經(jīng)驗(yàn)支持的、關(guān)鍵參數(shù)控制基本明確、過程監(jiān)測數(shù)據(jù)較為充分、藥學(xué)可控度高等；并在開展早期臨床研究的同時(shí)，繼續(xù)按照常規(guī)注冊要求進(jìn)行多批次生產(chǎn)，以確認(rèn)工藝的穩(wěn)健性和可控程度。

2.8 采用非建庫或非單克隆細(xì)胞庫模式的考量 為加快臨床樣品研究，部分申報(bào)單位提出，采用瞬轉(zhuǎn)或非單克隆細(xì)胞池技術(shù)進(jìn)行藥理毒理和／ 或早期臨床樣品工藝開發(fā)研究。盡管采用瞬轉(zhuǎn)或非單克隆細(xì)胞池生產(chǎn)可適當(dāng)縮短工藝開發(fā)周期，但其帶來的不同批次產(chǎn)品質(zhì)量的不確定性和變異性也需格外關(guān)注。建議根據(jù)疫情發(fā)展的急迫程度以及對產(chǎn)品工藝變化導(dǎo)致的影響產(chǎn)品質(zhì)量的控制能力，慎重考慮并制定早期工藝開發(fā)路線圖。原則上，建議采用經(jīng)篩選的單克隆細(xì)胞建庫生產(chǎn)臨床試驗(yàn)樣品。

如擬采用瞬轉(zhuǎn)或非單克隆細(xì)胞池進(jìn)行IND 申報(bào)，需充分證明其建立的瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)、非單克隆細(xì)胞池能支持后續(xù)研發(fā)，并提供細(xì)胞庫的檢驗(yàn)報(bào)告，確保可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，且無內(nèi)、外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)。

若采用瞬轉(zhuǎn)技術(shù)產(chǎn)品用于早期臨床，需提供足夠的工藝信息（至少覆蓋3 批樣品），以證明瞬轉(zhuǎn)技術(shù)的穩(wěn)健性及一致性；需提供至少3 批樣品的全面特性分析（如翻譯后修飾等）、質(zhì)量研究及穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)，并提供3 批樣品制造和檢定記錄，以證明瞬轉(zhuǎn)技術(shù)的產(chǎn)品質(zhì)量及穩(wěn)定性批間一致。應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注安全性相關(guān)的藥學(xué)研究，包括工藝相關(guān)物質(zhì)、產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)及遺傳毒性雜質(zhì)分析和控制，關(guān)注檢測方法的特異性、靈敏度等方法學(xué)驗(yàn)證研究。

若采用非單克隆細(xì)胞池生產(chǎn)，需提供非單克隆細(xì)胞池支持臨床樣品生產(chǎn)的傳代穩(wěn)定性信息，代表性批次（藥理毒理批次、臨床樣品批次）的工藝信息、特性分析（如翻譯后修飾等）、質(zhì)量研究及穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)，以證明非單克隆細(xì)胞池傳代及生產(chǎn)的穩(wěn)健性及質(zhì)量一致性。

若采用瞬轉(zhuǎn)或非單克隆細(xì)胞池生產(chǎn)，后續(xù)研究還需評估瞬轉(zhuǎn)技術(shù)、非單克隆細(xì)胞池造成的產(chǎn)品質(zhì)量差異對藥學(xué)、非臨床研究以及臨床試驗(yàn)的影響；應(yīng)證明非臨床研究用藥物與擬進(jìn)行臨床試驗(yàn)用藥物的相關(guān)性，為后續(xù)臨床試驗(yàn)提供安全性支持。如研究資料證明不足以支持產(chǎn)品安全性和批間一致性，將導(dǎo)致臨床研究的停滯［11］。

3 討 論

3.1 平臺知識 既往有關(guān)應(yīng)急疫苗研發(fā)或生產(chǎn)的平臺知識、工藝知識、產(chǎn)品知識等將有利于本次應(yīng)急產(chǎn)品研發(fā)的評價(jià)，鼓勵(lì)產(chǎn)品知識、工藝知識積累較多的平臺化產(chǎn)品與創(chuàng)新結(jié)合快速開發(fā)。根據(jù)研發(fā)疫苗的作用機(jī)制、遞呈方式和免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)等核心要點(diǎn)，對研發(fā)制備工藝中的關(guān)鍵步驟進(jìn)行研究，建立合理的過程控制、技術(shù)參數(shù)范圍及初步適用的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 臨床期間需進(jìn)一步完善的藥學(xué)研究 新冠疫苗的藥學(xué)研究針對重大公共衛(wèi)生緊急需求研發(fā)，其階段性、漸進(jìn)性的特點(diǎn)需提前統(tǒng)籌設(shè)計(jì)考慮，在符合基本的安全性、有效性及質(zhì)量可控性的前提下，新冠重組疫苗可有條件批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。臨床試驗(yàn)期間，可進(jìn)一步完善相關(guān)藥學(xué)研究，包括且不限于更全面的結(jié)構(gòu)確證、完善的方法學(xué)驗(yàn)證、糖基化修飾及有關(guān)物質(zhì)對疫苗效力的影響、包材相容性、完善的穩(wěn)定性研究等。

4 小 結(jié)

新冠重組疫苗的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制可部分參照重組生物技術(shù)產(chǎn)品的技術(shù)指導(dǎo)原則，但由于新冠病毒屬新型病毒，高級結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾又較為復(fù)雜，建議研發(fā)機(jī)構(gòu)遵循質(zhì)量源于設(shè)計(jì)的原則，在分子及工藝設(shè)計(jì)科學(xué)合理的前提下，循序漸進(jìn)完成藥學(xué)部分的研發(fā)。在新冠疫苗的早期研發(fā)中，藥學(xué)研究作為非臨床研究及臨床研究的基礎(chǔ)，可為非臨床研究及臨床試驗(yàn)的實(shí)施提供支持，早期藥學(xué)研究的科學(xué)規(guī)范可為臨床研究的順利開展奠定良好的基礎(chǔ)。