劉 波，漆輝洲，王五洲，馬 云，肖方竹，郭思思，何淑雅

(南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南省衡陽(yáng)市421001)

過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide)，俗稱雙氧水，分子式為H2O2，溶于水、醇、醚等[1]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)用、食品及工業(yè)消毒等領(lǐng)域，易分解為水和氧氣，無(wú)殘留毒性，不會(huì)造成環(huán)境的再次污染[2-3]。過(guò)氧化氫作為一種強(qiáng)氧化劑，可破壞線粒體功能和損傷脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，進(jìn)而啟動(dòng)由Caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[4]，且ROS在各種信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)中也起著重要作用[5-6]；一旦過(guò)氧化氫作用于細(xì)胞濃度超過(guò)某個(gè)水平，細(xì)胞會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷[7]。

果蠅具有飼養(yǎng)簡(jiǎn)便、反應(yīng)靈敏、75%的基因與人類疾病相關(guān)基因同源等優(yōu)點(diǎn)[8]，且其發(fā)育過(guò)程和代謝機(jī)制與哺乳動(dòng)物類似，故較多地將其應(yīng)用于衰老或壽命等方面的研究[9]。本研究以W1118品系果蠅為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)喂食含過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基，觀察果蠅的生長(zhǎng)情況，研究過(guò)氧化氫對(duì)果蠅的壽命、生育能力、運(yùn)動(dòng)能力及抗氧化能力的影響，以期為過(guò)氧化氫對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究提供證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

W1118品系果蠅，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。過(guò)氧化氫(上海雙儉)；丙酸(巴斯夫)；瓊脂粉(康倍斯)；酵母粉、蔗糖、黃豆粉及玉米粉(均購(gòu)自沃爾瑪超市)；PBS緩沖液(賽默飛)；谷胱甘肽(glutathione,GSH)和過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒(默沙克)；恒溫箱(湖南中美)。

1.2 果蠅培養(yǎng)

玉米-酵母培養(yǎng)基，恒溫25 ℃，相對(duì)濕度65%。基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制：取130 g玉米粉、77 g蔗糖、30 g大豆粉、13 g瓊脂粉以及900 mL蒸餾水倒入鍋中，煮沸30 min，待溫度降至55～60 ℃，加入6 mL丙酸和20 g酵母粉攪拌均勻后立即倒入培養(yǎng)管中，冷藏后使用[10-11]。過(guò)氧化氫培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同量的過(guò)氧化氫，攪拌均勻后倒入培養(yǎng)管中，配制成最終含400、800和1 200 mmol/L過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基，0 mmol/L過(guò)氧化氫的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照組。

1.3 果蠅壽命測(cè)定

收集未交配的處女蠅和雄果蠅，隨后隨機(jī)挑取雌雄果蠅各50只放入基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含400、800、1 200 mmol/L過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基中，每組設(shè)5個(gè)平行管。每日18:00對(duì)果蠅存活情況進(jìn)行觀察和記錄，培養(yǎng)過(guò)程中每隔2天更換一次新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)觀察直至果蠅全部死亡。記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算最高壽命(最后10只死亡果蠅的平均壽命)、壽命和半數(shù)死亡時(shí)間。

1.4 果蠅生育能力測(cè)定

在準(zhǔn)備好的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中放入果蠅，產(chǎn)卵12 h后移除親本，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求采集1日齡幼蟲(chóng)，分別放入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含400、800、1 200 mmol/L過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行充分培養(yǎng)。各組培養(yǎng)基中均放置50只幼蟲(chóng)，每組設(shè)5個(gè)平行管，觀察蛹化和羽化情況。蛹化率(%)=蛹化總數(shù)/卵總數(shù)×100%；羽化率(%)=羽化總數(shù)/卵總數(shù)×100%[12]。

1.5 果蠅羽化后48 h死亡率測(cè)定

在各濃度培養(yǎng)基羽化的成蟲(chóng)中，均隨機(jī)挑選20只成蟲(chóng)，每組設(shè)5個(gè)平行管，每隔8 h觀察成蟲(chóng)存活情況直至48 h，以確定幼蟲(chóng)羽化為成蟲(chóng)后48 h的死亡率。果蠅羽化后48 h死亡率(%)=羽化后48 h死亡果蠅總數(shù)/羽化果蠅總數(shù)×100%。

1.6 果蠅運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定

收集3日齡果蠅，分別放入基礎(chǔ)培養(yǎng)基和含400、800、1 200 mmol/L過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7天后，每組隨機(jī)挑取50只果蠅且每組設(shè)5個(gè)平行管，輕晃果蠅至培養(yǎng)管底部并塞好瓶塞，記錄5 s內(nèi)果蠅到達(dá)培養(yǎng)管頂部的數(shù)量。攀爬指數(shù)(%)=5 s內(nèi)到達(dá)頂部的果蠅數(shù)/果蠅總數(shù)×100%[13]。攀爬指數(shù)越高說(shuō)明運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)，反之越小。

1.7 果蠅抗氧化活性測(cè)定

收集3日齡果蠅，從基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)照組和含400、800、1 200 mmol/L過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基處理組中每組隨機(jī)各挑取雌、雄果蠅20只于離心管中，每組設(shè)5個(gè)平行管，加入適量的PBS緩沖液，在液氮中充分研磨成10%組織勻漿[14]，4 ℃ 2 500 r/min離心15 min，取上清，嚴(yán)格按照默沙克公司的試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定GSH含量和CAT活力。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅壽命的影響

400 mmol/L過(guò)氧化氫處理組雌雄果蠅半數(shù)死亡時(shí)間、最高壽命及雌果蠅壽命與對(duì)照組相比均明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，1 200 mmol/L過(guò)氧化氫處理組雌雄果蠅半數(shù)死亡時(shí)間、壽命及最高壽命與對(duì)照組相比均明顯縮短(P<0.05；圖1)；濃度為800 mmol/L條件下，雄果蠅平均壽命與對(duì)照組相比明顯縮短。

圖1 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅壽命的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對(duì)照組比較。

2.2 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅生育能力的影響

在800 mmol/L和1 200 mmol/L條件下，果蠅的蛹化率明顯低于對(duì)照組(P<0.05；圖2)；不同濃度過(guò)氧化氫處理組果蠅的羽化率均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，且果蠅生育能力隨著過(guò)氧化氫濃度的提高而逐漸減弱，呈劑量依賴性關(guān)系。

圖2 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅生育能力的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對(duì)照組比較。

2.3 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅羽化后48 h死亡率的影響

400、800、1 200 mmol/L過(guò)氧化氫處理組果蠅羽化后48 h死亡率明顯高于對(duì)照組P<0.05；圖3)，且果蠅羽化后48 h死亡率隨著過(guò)氧化氫濃度的提高而逐漸升高，呈劑量依賴性關(guān)系。

圖3 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅羽化后48 h死亡率的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對(duì)照組比較。

2.4 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅運(yùn)動(dòng)能力的影響

400、800 mmol/L、1 200 mmol/L過(guò)氧化氫處理組果蠅的運(yùn)動(dòng)能力與對(duì)照組相比均明顯減弱(P<0.05；圖4)，且隨著過(guò)氧化氫濃度的提高而逐漸減弱，呈劑量依賴性關(guān)系。

圖4 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅運(yùn)動(dòng)能力的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對(duì)照組比較。

2.5 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅抗氧化活性的影響

800、1 200 mmol/L過(guò)氧化氫處理組果蠅GSH含量和CAT活力與對(duì)照組相比均明顯降低(P<0.05；圖5)。

圖5 過(guò)氧化氫對(duì)果蠅抗氧化活性的影響a為P<0.05，與0 mmol/L對(duì)照組比較。

3 討 論

過(guò)氧化氫常用于醫(yī)用、環(huán)境和食品等領(lǐng)域的消毒，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、細(xì)菌孢子和病毒等有抗菌效果，產(chǎn)生抗菌作用的機(jī)制可能是過(guò)氧化氫降解釋放的ROS導(dǎo)致DNA鏈斷裂[15]；同時(shí)，過(guò)氧化氫可經(jīng)皮膚、消化道及呼吸道等不同途徑進(jìn)入人體產(chǎn)生一定的毒性[16-17]，產(chǎn)生毒性的機(jī)制主要有三種：腐蝕損傷、氧氣生成和脂質(zhì)過(guò)氧化[18]。果蠅易于操作，喂養(yǎng)簡(jiǎn)單，繁殖力高、染色體數(shù)目少，且其代謝途徑、生理功能和發(fā)育階段與哺乳動(dòng)物類似等特性，故常被用作生物模型來(lái)研究動(dòng)物行為、發(fā)育和抗衰老和抗氧化等[19-20]。本研究以W1118品系果蠅為研究對(duì)象，研究過(guò)氧化氫對(duì)果蠅壽命、生育能力以及運(yùn)動(dòng)能力的影響，并以GSH含量和CAT活力為指標(biāo)評(píng)價(jià)了果蠅的抗氧化能力。結(jié)果表明:隨著過(guò)氧化氫濃度的增加，果蠅蛹化率和羽化率降低、運(yùn)動(dòng)能力減弱、羽化后48 h死亡率升高；當(dāng)過(guò)氧化氫為400 mmol/L時(shí)，果蠅體內(nèi)GSH含量和CAT活力較對(duì)照組升高，可能是由于果蠅在低濃度過(guò)氧化氫刺激時(shí)，激活了果蠅體內(nèi)的保護(hù)機(jī)制，誘導(dǎo)產(chǎn)生了GSH和CAT，進(jìn)而及時(shí)清除自由基，避免自由基對(duì)果蠅的進(jìn)一步損傷，而當(dāng)過(guò)氧化氫濃度較高時(shí)，果蠅機(jī)體產(chǎn)生的自由基超過(guò)了機(jī)體的清除能力，即GSH和CAT產(chǎn)生的速度跟不上機(jī)體內(nèi)自由基增加的速度，從而造成果蠅組織細(xì)胞的損傷，使GSH含量和CAT活力降低；當(dāng)過(guò)氧化氫濃度為1 200 mmol/L時(shí)效果最為明顯(P<0.05)，這時(shí)果蠅體內(nèi)GSH含量和CAT活性與對(duì)照組相比明顯減少(P<0.05)；當(dāng)過(guò)氧化氫濃度較高時(shí)，果蠅可能因此提前衰老、死亡、運(yùn)動(dòng)能力減弱甚至喪失生育能力。

昆蟲(chóng)受到脅迫后會(huì)產(chǎn)生較多的ROS[21]。低水平的ROS對(duì)機(jī)體無(wú)害且在信號(hào)傳輸中起著很重要的作用[22]。當(dāng)體內(nèi)ROS水平超過(guò)一定濃度時(shí)可導(dǎo)致昆蟲(chóng)機(jī)體氧化損傷[7]，為了有效防止ROS對(duì)機(jī)體的破壞，昆蟲(chóng)體內(nèi)可形成一個(gè)包括酶和非酶組分的抗氧化系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)[23]。過(guò)多的自由基細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，可破壞生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體疾病甚至死亡[24-25]。過(guò)氧化氫可通過(guò)破壞正常線粒體功能和損傷DNA誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，本研究果蠅GSH含量和CAT活性減少，說(shuō)明過(guò)氧化氫降低了果蠅對(duì)自由基及其產(chǎn)物的清除能力，從而造成果蠅功能障礙。

本研究結(jié)果表明，果蠅壽命縮短、生育能力和運(yùn)動(dòng)能力下降的同時(shí)，其體內(nèi)GSH含量和CAT活性也相應(yīng)減少，說(shuō)明過(guò)氧化氫對(duì)果蠅壽命、生育能力和運(yùn)動(dòng)能力的不利影響可能與其誘發(fā)的氧化損傷有關(guān)，機(jī)制可能是通過(guò)降低體內(nèi)抗氧化組分含量從而減弱抗氧化損傷的能力，使得體內(nèi)自由基積累導(dǎo)致?lián)p傷加劇，從而減弱了果蠅的生育能力和運(yùn)動(dòng)能力、加速了果蠅的死亡進(jìn)程等。影響果蠅的生理生化功能的因素是多方面的，也是一個(gè)復(fù)雜且值得探討的課題。本研究為過(guò)氧化氫對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的危害提供了理論依據(jù)，可為農(nóng)業(yè)園林害蟲(chóng)防治工作提供參考意見(jiàn)，一定程度上可促進(jìn)農(nóng)業(yè)園林業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也可規(guī)范當(dāng)下新冠肺炎疫情防控消殺用品等的正確使用。