張 丹，田 姍，李 翔，牟尚東

(三二〇一醫(yī)院腫瘤內一科，陜西省漢中市723000)

肺癌是對人類威脅最大的惡性腫瘤之一，近年其發(fā)病率和死亡率增長快，根據(jù)全球數(shù)據(jù)統(tǒng)計，每年新增肺癌確診患者約100萬人，約80萬人因肺癌死亡[1]。在中國，肺癌為排名第一位的惡性腫瘤，其病因至今尚未完全明確，多數(shù)學者認為與長期吸煙密切相關[2]。肺鱗狀細胞癌是肺癌常見類型，經(jīng)腫物切除、內分泌治療、放化療等傳統(tǒng)治療手段治療后，生存率有所提高，但治療效果仍不理想。因此，從肺癌發(fā)病機制尋找突破口，研究其特異性生物學標志物和治療靶標具有重要意義[3]。本研究對80例肺鱗狀細胞癌組織、80例癌旁正常肺組織的臨床特征及生存資料進行回顧性分析，探討Erbin在肺鱗狀細胞癌中的表達及其與患者預后的關系，為提高其臨床診治水平提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選取本院2011年3月—2015年3月手術切除的80例肺鱗狀細胞癌組織以及同期80例癌旁正常肺組織標本，均經(jīng)病理確診，所有患者術前均未經(jīng)過化療或放療。肺鱗狀細胞癌組織80例，其中男51例，女29例，年齡35～84歲，中位年齡62歲，平均(57.3±6.1)歲；其中高分化28例，中分化32例，低分化20例；TNM分期[4]：Ⅰ期19例，Ⅱ期23例，Ⅲ期38例。同期癌旁正常肺組織80例，均距離腫瘤邊緣5 cm以上，經(jīng)病理證實無腫瘤細胞浸潤；其中男49例，女31例，年齡36～84歲，中位年齡62歲，平均(57.27±8.08)歲。本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

所有患者均以門診復查、電話等方式隨訪，隨訪資料完整，剔除中途退出研究或失訪患者。隨訪時間為2015年3月—2020年3月，隨訪周期為第1年每3個月1次，第2～3年每3～6個月1次，第3～5年每6個月1次，5年后1年隨訪1次，生存時間以月為單位計算。

1.2 主要試劑

Erbin檢測應用兔抗人多克隆抗體Erbin，購自英國Abcan公司，顯色劑為二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)和PV9000免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)二抗試劑盒均購自福州邁新生物公司。

1.3 臨床資料的搜集

通過查閱患者住院記錄、各種輔助檢查單、隨訪記錄等病案資料，采用統(tǒng)一調查表摘錄相關內容，主要內容包括年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、轉移情況、末次隨訪時間和生存時間等。

1.4 免疫組織化學染色

石蠟包埋切片處理，復染脫水處理，采用高壓修復抗原，切片與一抗Erbin在4 ℃條件下孵育過夜，Erbin使用滴度為1∶100。第2天經(jīng)過磷酸緩沖鹽溶液沖洗后，進行蘇木精伊紅(HE)染色和DBA顯色處理，最后顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組織化學結果判斷

Erbin陽性表達判斷標準：在腫瘤細胞胞質或胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性。由病理科醫(yī)師選擇腫瘤和癌旁正常肺組織的蠟塊做切片，染色成功后顯微鏡下任意選擇5個視野，每個視野下計數(shù)100個細胞。根據(jù)細胞陽性著色強弱，未出現(xiàn)著色記為0分；淺黃色或者黃色記為1分；棕黃色記為2分；棕褐色記為3分。陽性細胞百分數(shù)分級：陽性細胞<10%為0分，10%～30%為1分，30%～60%為2分，≥60%為3分。最后綜合陽性強度和陽性細胞數(shù)評分，以兩者的乘積為最后得分。0～1分為Erbin陰性表達，2～12分為Erbin陽性表達[5]。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 兩組Erbin表達的比較

正常肺組織免疫組織化學染色結果顯示，Erbin的陽性表達主要位于鱗狀上皮基底細胞，且定位在細胞的胞質中。肺鱗狀細胞癌組織免疫組織化學染色結果顯示，Erbin的陽性表達也定位在細胞的胞質中，呈淺黃色至棕黃色顆粒(圖1)。肺鱗狀細胞癌組織Erbin陽性61例，陽性率為76.25%，癌旁正常肺組織Erbin陽性15例，陽性率為18.75%，兩組Erbin陽性率比較差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=53.033，P=0.001)。

圖1 Erbin在正常肺組織、肺鱗狀細胞癌組織中的表達(100×)

2.2 肺鱗狀細胞癌組織Erbin表達與臨床病理因素的關系

肺鱗狀細胞癌組織Erbin的表達與性別、年齡無關(P>0.05)；與患者腫瘤分化類型、腫瘤浸潤深度、臨床TNM分期、有無淋巴結轉移相關(P<0.05；表1)。

表1 肺鱗狀細胞癌組織Erbin表達與臨床病理因素的關系 單位：例(%)

2.3 不同Erbin表達肺鱗狀細胞癌患者生存情況的比較

80例肺鱗狀細胞癌患者隨訪存活1～73個月，中位生存期為36個月，術后1、3、5年生存率分別為76.25%(61/80)、52.50%(42/80)、33.75%(27/80)。Erbin表達陰性患者隨訪存活1～73個月，中位生存期39個月；Erbin表達陽性患者隨訪存活1～67個月，中位生存期27個月；Erbin表達陰性患者術后1、3、5年生存率(78.95%、52.63%和36.84%)明顯高于Erbin表達陽性患者(50.82%、32.79%和18.03%)(P<0.001；圖2)。

圖2 不同Erbin表達水平肺鱗狀細胞癌患者生存曲線的比較

2.4 肺鱗狀細胞癌患者累積生存率單因素分析

經(jīng)Log-rank檢驗單因素分析顯示：不同年齡段、性別的肺鱗狀細胞癌患者，生存率比較差異無顯著性(P>0.05)；不同分化類型、臨床TNM分期、是否伴有淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度、是否Erbin表達陽性的肺鱗狀細胞癌患者生存率比較差異有顯著性(P<0.05；表2)。

表2 肺鱗狀細胞癌患者累積生存率單因素分析 單位：例(%)

2.5 肺鱗狀細胞癌患者預后多因素分析

經(jīng)多元Cox逐步回歸分析，臨床分期晚(Ⅲ期)、伴有淋巴結轉移、浸潤深度>深層肌肉層、高分化類型、Erbin表達陽性為肺鱗狀細胞癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05；表3)。

表3 肺鱗狀細胞癌患者預后多元逐步Cox回歸分析結果

3 討 論

肺鱗狀細胞癌是肺癌中的常見類型，因疾病進展、淋巴結轉移、化療或放療抵抗等原因，手術時患者多已處于中晚期，且經(jīng)手術治療后，術后5年生存率仍然較低。隨著當前醫(yī)療技術、靶向治療等綜合治療的應用，術后生存率有所提高，但肺癌仍然是人類致死的主要疾病之一[6-7]。近年來，分子生物學與基因技術不斷發(fā)展，惡性腫瘤診治水平邁上了新臺階[8]。Erbin是一種新的Her2相互作用蛋白，是LAP蛋白家族成員之一[9]。目前有研究報道，LAP家族蛋白Erbin、Seribble、Let413等在上皮細胞極性形成中發(fā)揮了重要作用[10]。Erbin在腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有兩面性，文獻[11-12]報道，Erbin在乳腺癌、肝細胞肝癌患者中呈過表達，Erbin可通過調節(jié)ErbB2 的穩(wěn)定性和活性來調控乳腺癌、肝細胞肝癌的發(fā)生、發(fā)展。而張珊等[13]在宮頸癌生物學分子標志物的研究中發(fā)現(xiàn)，Erbin能通過抑制細胞進程而降低癌細胞的增殖。然而，Erbin在肺鱗狀細胞癌中扮演何種角色尚存在爭論。

有研究顯示，Erbin在表皮上部細胞的細胞膜中染色，在皮膚表皮基底層細胞胞質中染色，在表皮鱗狀細胞癌組織細胞胞質中呈淺黃色至棕黃色顆粒，表達水平顯著升高[14-15]。在本研究中，Erbin在肺鱗狀細胞癌組織中呈淺黃色至棕黃色顆粒，陽性表達率明顯高于癌旁正常肺組織中陽性表達率，表明Erbin表達上調與某些腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展相關，且表達量與腫瘤的分期、進展密切相關。本研究80例肺鱗狀細胞癌患者中61例Erbin表達陽性，且這些患者腫瘤浸潤深度>深層肌肉層，主要呈高分化類型，臨床TNM分期更高，更容易出現(xiàn)淋巴結轉移。結果說明，Erbin在肺鱗狀細胞癌進展中扮演了重要角色，其不僅參與了腫瘤的臨床進展，也參與了腫瘤的淋巴結轉移。而在直腸癌患者研究中報道，Erbin蛋白表達量降低，并通過抑制ERK和Akt信號通路的活性而起抑癌作用[16-17]。故而，Erbin在不同信號通路中的作用仍然需進一步深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，Erbin表達陽性的肺鱗狀細胞癌患者生存時間明顯短于Erbin表達陰性患者，結果說明Erbin在肺鱗狀細胞癌的進展中扮演了促癌角色，Erbin可作為臨床上判斷腫瘤預后的參考指標，對Erbin表達陽性的肺鱗狀細胞癌患者術后應進行化療或放療輔助治療，以延長預后生存時間。然而經(jīng)過COX回歸模型分析顯示，Erbin表達陽性、臨床TNM分期高、腫瘤浸潤深度>深層肌肉層、伴有淋巴結轉移、高分化類型等因素為肺鱗狀細胞癌患者預后的獨立危險因素。此類腫瘤預后差可能是因為：①在肺鱗狀細胞癌患者中Erbin高表達使機體免疫受到抑制[18-19]；②同時Erbin過表達基因異常，癌細胞生長加快，侵犯脈管形成癌栓，從而導致淋巴結轉移，臨床進展較快[20]。眾所周知，基質金屬蛋白酶(MMPs)可以通過降解細胞外基質而在腫瘤細胞的侵襲轉移中發(fā)揮重要作用，在本研究中肺鱗狀細胞癌Erbin是否通過增強MMPs的活性而發(fā)揮促癌作用，需加大樣本量，借助肺鱗狀細胞癌細胞系去進一步驗證。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)Erbin的表達在肺鱗狀細胞癌組織中明顯增加，且Erbin陽性表達與肺鱗狀細胞癌患者的不良預后密切相關，這為將來開發(fā)針對Erbin的腫瘤靶向藥物提供了實驗依據(jù)，而明確Erbin促進肺鱗狀細胞癌細胞侵襲轉移的機制是本課題組下一步的研究方向。