劉遠(yuǎn)波，王 霞，包太成，李南京，譚秋芬，林小龍

(1. 惠州市第六人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東省惠州市516211；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬惠州醫(yī)院惠州市第三人民醫(yī)院病理科，廣東省惠州市516002)

葡萄糖是中樞神經(jīng)系統(tǒng)必需的能量底物，神經(jīng)元需要大量的葡萄糖來(lái)滿足其高能量的需求。與依賴胰島素的肌肉細(xì)胞或脂肪細(xì)胞不同，神經(jīng)元的葡萄糖攝取主要取決于其細(xì)胞外濃度。如神經(jīng)元長(zhǎng)期暴露于葡萄糖中會(huì)引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并導(dǎo)致神經(jīng)病理性并發(fā)癥，如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的發(fā)生[1-2]。最新的研究也顯示PD的發(fā)生與2型糖尿病密切相關(guān)[3]。白藜蘆醇(resveratrol，RESV)是一種多酚類天然化合物，其因強(qiáng)大的抗氧化、抗炎和心肌保護(hù)作用而備受關(guān)注[4]。近年來(lái)，大量研究證實(shí)RESV可以通過趨化因子受體4(CXC chemokine receptors 4，CXC4)、磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸-蘇氨酸激酶(PI3K/Akt)等途徑拮抗缺血再灌注所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[5-6]。雖然白藜蘆醇在神經(jīng)退行性疾病中有較好的防御作用，但其在保護(hù)神經(jīng)元免受高糖(high glucose，HG)損傷方面的作用及機(jī)制尚待闡明。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silence information regulator 1,SIRT1)是SIRT家族的重要成員，具有抗衰老的作用，研究顯示，在腦缺血時(shí)SIRT1活性增強(qiáng)，細(xì)胞生命周期延長(zhǎng)，抵抗應(yīng)激能力增加，對(duì)致命性腦缺血起到神經(jīng)保護(hù)作用[7]。此外，研究顯示SIRT1在高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷時(shí)，具有拮抗氧化應(yīng)激的能力[8]，表明SIRT1可能是神經(jīng)細(xì)胞拮抗應(yīng)激損傷的重要靶標(biāo)。因此，本研究擬以PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，闡明RESV是否通過誘導(dǎo)SIRT1的活化抑制HG導(dǎo)致的PC12細(xì)胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料

甲基噻唑基四唑侖(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、Hoechst33258、20，70二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)、D-葡萄糖及白藜蘆醇均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；SIRT1、p-SIRT1、AMP活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase,AMPK)、p-AMPK及SIRT1抑制劑均購(gòu)自Abcam公司；PCR試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物有限公司；所有細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑均購(gòu)自Thermo Fisher公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)劑購(gòu)自碧云天生物有限公司；其余試劑均購(gòu)自國(guó)內(nèi)外分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

PC12細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 kU/L青霉素及100 kU/L鏈霉素)，在37 ℃5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。每2天傳代1次。傳代后，PC12細(xì)胞以2×106個(gè)/孔進(jìn)行接種，接種條件為10%小牛血清孵育24 h，隨后改為0.5%FBS RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓24 h。

PC12細(xì)胞分為4組。對(duì)照組為5 mmol/L葡萄糖孵育24 h；高糖組(HG組)為50 mmol/L葡萄糖孵育24 h；白藜蘆醇組為10 μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理2 h；高糖+白藜蘆醇組為白藜蘆醇組基礎(chǔ)上用高糖處理24 h。

1.3 MTT檢測(cè)

PC12細(xì)胞按5×103個(gè)/孔置于96孔板中，按照分組培養(yǎng)細(xì)胞。隨后在每孔加入10 μL MTT溶液，于37 ℃孵育4 h。最后在光密度470 nm處進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 Hoechst33258核染色評(píng)估細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞處理后，用冰凍4%多聚甲醛固定30 min，隨后浸泡于PBS溶液中20 min。PBS浸泡后用含5%山羊血清的0.3%TritonX-100封閉2 h。封閉完成后用PBS洗滌2次，每次20 s，最后加入10 mg/L Hoechst33258染液在常溫暗室中孵育15 min。孵育完成后用熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞情況。凋亡細(xì)胞表現(xiàn)出凝聚、斷裂或扭曲的細(xì)胞核；活細(xì)胞表現(xiàn)出正常的核大小和均勻的熒光。

1.5 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)

通過測(cè)定DCFH-DA氧化形成的熒光產(chǎn)物，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平。去除培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，隨后PBS洗滌細(xì)胞3次。加入新鮮培養(yǎng)基后，用10 μmol/L DCFH-DA在37 ℃下孵育30 min。隨后再用PBS再次洗滌細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察并采集圖像。使用Image J 1.41軟件測(cè)量5個(gè)隨機(jī)場(chǎng)平均熒光強(qiáng)度，結(jié)果以各組熒光強(qiáng)度與試劑盒陽(yáng)性試劑熒光強(qiáng)度的百分比表示。

1.6 蛋白印跡分析

收集各組細(xì)胞，提取各組細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，用BAC試劑盒(按說(shuō)明書操作)測(cè)定各組蛋白質(zhì)水平，按SDS-PAGE試劑盒操作說(shuō)明，配置5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行電泳，電泳完畢后根據(jù)Marker顯示的位置，切取各個(gè)目標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的相應(yīng)膠帶進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為200 mA恒流2 h，隨后用TBST配置5%牛奶封閉2 h。一抗過夜，兔抗SIRT1單克隆抗體(1∶2 000)，兔抗p-SIRT1(Ser473)單克隆抗體(1∶2 000)，兔抗AMPK多克隆抗體(1∶2 000)，兔抗p-AMPK(Ser253)多克隆抗體(1∶1 000)。次日，將膜取出，在TBST中洗滌膜3次，隨后加入二抗孵育2 h。然后在TBST洗滌3次，隨后加入ECL發(fā)光試劑，并在天能5200SE凝膠系統(tǒng)中進(jìn)行照片拍攝及分析。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)TRIZOL試劑說(shuō)明書對(duì)相關(guān)的樣本進(jìn)行RNA提取。按照Taqman反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄1 μg RNA。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書中的方法,利用SIRT1和AMPK引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),并選擇人GAPDH作為內(nèi)參基因。引物序列如下：SIRT1前導(dǎo)鏈引物5′-TAG CCT TGT CAG ATA AGG AAG GA-3′，SIRT1后隨鏈引物5′-ACA GCT TCA CAG TCA ACT TTG T-3′；AMPK前導(dǎo)鏈引物5′-TTG AAA CCT GAA AAT GTC CTG CT-3′，AMPK后隨鏈引物5′-CAG GGA TGT GAT CGG CAC TT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche)中,按程序進(jìn)行。預(yù)溫育50 ℃110 s，95 ℃120 s，1個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增60 ℃55 s，95 ℃15 s，55個(gè)循環(huán);解鏈95 ℃15 s，65 ℃60 s，97 ℃3 s，1個(gè)循環(huán)；冷卻37 ℃30 s，1個(gè)循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 HG對(duì)PC12細(xì)胞SIRT1和AMPK表達(dá)及磷酸化的影響

與對(duì)照組比較，用50 mmol/L HG處理PC12細(xì)胞不同時(shí)間，SIRT1和AMPK RNA及總蛋白水平?jīng)]有發(fā)生改變(圖1)，但磷酸化蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，磷酸化水平明顯下調(diào)，并呈現(xiàn)出一定的時(shí)間依賴性。處理6 h后，p-SIRT1及p-AMPK的表達(dá)下降明顯，在處理24 h時(shí)下降最為明顯(P<0.05，P<0.01；圖1)。

圖1 HG對(duì)PC12細(xì)胞SIRT1和AMPK表達(dá)及磷酸化的影響A和B為RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；C和D為Western blot檢測(cè)結(jié)果。1為對(duì)照組；2～6分別為HG 0、3、6、12和24 h組。a為P<0.05,b為P<0.01，與對(duì)照組比較。

2.2 RESV對(duì)HG處理PC12細(xì)胞SIRT1和AMPK表達(dá)及磷酸化的影響

RESV預(yù)處理30 min，隨后HG處理細(xì)胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與HG組比較，HG+RESV組可顯著提高細(xì)胞內(nèi)p-SIRT1的水平，但并不影響總SIRT1蛋白表達(dá)，對(duì)SIRT1下游分子AMPK蛋白進(jìn)行檢測(cè)，p-AMPK的表達(dá)水平與p-SIRT1表達(dá)相一致(P<0.05，P<0.01；圖2)。

圖2 RESV對(duì)HG處理的PC12細(xì)胞SIRT1和AMPK表達(dá)及磷酸化的影響1為對(duì)照組；2為高糖組；3為白藜蘆醇組；4為高糖+白藜蘆醇組。a為P<0.01，與對(duì)照組比較；b為P<0.01，與高糖組比較。

2.3 HG對(duì)PC12細(xì)胞ROS、凋亡率及存活率的影響

與對(duì)照組比較，HG處理6 h后PC12細(xì)胞ROS水平及凋亡率明顯增加，細(xì)胞存活率明顯降低，24 h時(shí)該作用更為顯著(P<0.05，P<0.01；圖3和表1)。

圖3 HG對(duì)PC12細(xì)胞ROS水平及凋亡的影響上圖為熒光光度法檢測(cè)PC12細(xì)胞ROS水平(200×)；下圖為Hoechst33258核染色檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡情況(400×)。

表1 HG對(duì)PC12細(xì)胞ROS水平、凋亡率及存活率的影響 單位：%

2.4 RESV對(duì)HG誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ROS、凋亡率及存活率的影響

RESV預(yù)處理30 min，隨后HG處理細(xì)胞24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與HG組比較，HG+RESV組細(xì)胞ROS水平和凋亡率明顯下降，細(xì)胞存活率明顯提升(P<0.05，P<0.01；表2和圖4)。

表2 RESV對(duì)HG誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ROS水平、凋亡率及存活率的影響 單位：%

圖4 RESV對(duì)HG誘導(dǎo)PC12細(xì)胞ROS水平及凋亡的影響上圖為熒光光度法檢測(cè)細(xì)胞ROS水平(200×)；下圖為Hoechst33258核染色檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡情況(400×)。

3 討 論

糖尿病患者血糖調(diào)節(jié)異常所導(dǎo)致高血糖狀態(tài)是糖尿病神經(jīng)病變的主要原因[9-10]。目前對(duì)于高血糖致神經(jīng)病變的機(jī)制尚不清楚。越來(lái)越多的研究表明，氧化應(yīng)激與代謝綜合征、糖尿病、糖尿病神經(jīng)病變和多種神經(jīng)退行性疾病(如PD和AD)的進(jìn)展有關(guān)[11-12]。而ROS的產(chǎn)生是氧化應(yīng)激發(fā)生的基礎(chǔ)。研究證實(shí)，高血糖持續(xù)存在可促進(jìn)葡萄糖通過氧化作用形成晚期糖基化終產(chǎn)物產(chǎn)生ROS，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生直接毒性作用[13]。而持續(xù)的高糖刺激會(huì)上調(diào)神經(jīng)細(xì)胞β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1表達(dá)及ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而活化低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)及LXRα/ABCA1通路調(diào)節(jié)脂筏重組，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-淀粉樣蛋白沉積及細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)AD的進(jìn)展[14]。此外，高血糖會(huì)抑制天然抗氧化劑/活性氧清除機(jī)制，從而增加活性氧的累積，例如，高血糖會(huì)抑制硫氧還蛋白的ROS清除功能，硫氧還蛋白是一種通過p38 MAPK介導(dǎo)的硫醇還原酶[15]。而最新的研究發(fā)現(xiàn)，硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)在高血糖狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)明顯提高，并抑制細(xì)胞內(nèi)的線粒體自噬，增加細(xì)胞的ROS累積，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加速PD的進(jìn)展[16]。本文的結(jié)果同樣顯示，HG可促進(jìn)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生并引起神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用，表明ROS產(chǎn)生可能是引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要基礎(chǔ)。因此，抑制ROS的產(chǎn)生，對(duì)神經(jīng)退行性病變的防治具有重要的意義。

白藜蘆醇具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化及線粒體保護(hù)作用，并對(duì)神經(jīng)退行性疾病具有一定的預(yù)防和治療作用[17]。有研究證實(shí)，白藜蘆醇可通過激活PI3K/Akt/Nrf2信號(hào)通路，上調(diào)血紅素加氧酶-1的表達(dá)，抑制β淀粉樣蛋白沉積誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，有助于AD的治療[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過激活A(yù)MPK/PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)Tau蛋白磷酸酶2的表達(dá)，下調(diào)Tau蛋白激酶糖原合成酶激酶-3β的表達(dá)，從而抑制Tau蛋白過度磷酸化，改善AD相關(guān)癥狀[19]。此外，通過研究魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠模型證實(shí)，白藜蘆醇可通過激活谷胱甘肽過氧化物酶和Nrf2信號(hào)通路，顯著下調(diào)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78的表達(dá)，減弱Caspase-3和黃嘌呤氧化酶的活性，降低IL-1β水平，從而保護(hù)神經(jīng)元免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，恢復(fù)多巴胺水平，改善PD[20]。而課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過PI3K/Akt/Fox3a通路抑制HG誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[21]，表明白藜蘆醇具有拮抗HG誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的潛能，而這在本文中得到證實(shí)。SIRT1作為抗衰因子，其在腦缺血再灌注中的保護(hù)作用得到大量的研究證實(shí)，但在HG誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷中是否也具有保護(hù)作用，尚未見過多的文獻(xiàn)報(bào)道。本文在50 mmol/L HG誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型中，白藜蘆醇可以明顯促進(jìn)磷酸化SIRT1的表達(dá)，抑制HG所誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞存活率并抑制細(xì)胞凋亡，表明SIRT1可能是白藜蘆醇保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受HG損傷的潛在靶標(biāo)。課題組將會(huì)在將來(lái)的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

AMPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、自噬等病理生理過程的重要因子，目前大量研究證實(shí)SIRT1可通過誘導(dǎo)AMPK的磷酸化參與保護(hù)缺血再灌注所致的心肌或者神經(jīng)細(xì)胞的損傷[22]。而最新的研究顯示，在HG誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷中，白藜蘆醇可以通過SIRT1/AMPK通路拮抗氧化應(yīng)激所致的心肌損傷[23]。因此，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)SIRT1/AMPK通路可能也參與白藜蘆醇拮抗HG誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。故在本文中也對(duì)AMPK的表達(dá)以及磷酸化AMPK表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，HG可抑制PC12細(xì)胞p-AMPK的表達(dá)，而白藜蘆醇預(yù)處理后，HG的抑制作用被逆轉(zhuǎn)，表明白藜蘆醇可能是通過激活SIRT1/AMPK通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而這與以往文獻(xiàn)的報(bào)道結(jié)果相似[24]。

綜上，本研究結(jié)果提示HG可以抑制神經(jīng)細(xì)胞SIRT1和AMPK的磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡，而這種現(xiàn)象可被白藜蘆醇所抑制。此外，SIRT1活化被抑制后，白藜蘆醇的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)。表明白藜蘆醇是通過激活SIRT1/AMPK通路抑制高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。然而當(dāng)前的研究?jī)H限于體外實(shí)驗(yàn)，需要進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，而這也是課題組將來(lái)實(shí)施的目標(biāo)，而這可為白藜蘆醇的神經(jīng)保護(hù)作用提供新的理論依據(jù)，并為HG所致的神經(jīng)退行性病變提供新的治療靶標(biāo)。