鐘 亮，余義博，朱紅娟，曲家鵬

（1. 中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 青海省動物生態(tài)基因組學重點實驗室，青海 西寧 810008）

食物選擇是指動物對其棲息地中的食物種類做出選擇的行為，與動物自身生理狀態(tài)及環(huán)境中食物的可利用量密切相關(guān)[1]。影響食物選擇的因素主要包括：1)食物中營養(yǎng)成分含量[1]；2)動物的自身消化道結(jié)構(gòu)、集群類型及大小、性別、生理狀況等[2]；3)植物資源的季節(jié)性、地理位置分布以及生態(tài)環(huán)境的變化[3]；4)食物的氣味和味道[4]；5)植物次生代謝產(chǎn)物[5]。

食草動物和植物的采食-反采食協(xié)同進化形成了相互協(xié)調(diào)、相互制約的適應關(guān)系[1,6]。在長期進化過程中，植物對食草動物形成了防御系統(tǒng)，即物理和化學防御[7-8]，使動物的取食和消化代謝受到阻礙，從而讓動物在食物選擇上受到一定限制[1]。物理防御主要是利用植物自身的結(jié)構(gòu)，比如針、刺、棘等，使食草動物不易獲取其莖葉、果實等；而化學防御主要是指植物包含的次生代謝產(chǎn)物等抑制動物的食物攝入量、生長發(fā)育等[8-9]。

植物次生代謝產(chǎn)物是植物與環(huán)境在長期協(xié)同進化過程中形成的[10]，根據(jù)化學結(jié)構(gòu)的不同，次生代謝產(chǎn)物可分為酚類、萜類和含氮有機物等[11]。單寧酸是最常見的植物次生代謝產(chǎn)物之一，廣泛存在于植物中[11]。單寧酸味澀，能夠減少食草動物對植物的取食量[12]。單寧酸還能夠影響動物的形態(tài)、生理及行為等，取食較多的次生代謝產(chǎn)物后，動物會產(chǎn)生惡心嘔吐感[13]。單寧酸可與動物消化道內(nèi)的蛋白質(zhì)或酶結(jié)合形成絡合物，降低消化酶的活性，使腸道微生物菌群失調(diào)，降低動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[14-15]。單寧酸到達單胃動物的下胃腸道時，還可能改變腸上皮細胞的功能狀態(tài)，導致營養(yǎng)吸收和利用受損[16]。

小腸是動物消化吸收功能的基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收有重要作用。動物的營養(yǎng)狀況反過來也影響小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，特別是小腸的絨毛長度(villus length, V)、隱窩深度(crypt depth, C)、腸粘膜厚度以及絨毛表面積等[17-18]。小腸絨毛長度與細胞數(shù)量顯著相關(guān)，絨毛短時，成熟細胞少，小腸對營養(yǎng)成分吸收能力差；隱窩深度反映了細胞生成率，隱窩變淺，細胞成熟率升高，分泌功能加強。小腸絨毛長度/隱窩深度(V/C)與小腸的功能狀態(tài)相關(guān)，比值下降，表明小腸消化吸收功能減弱；比值升高，則小腸消化吸收功能增強，生長加快[19]。李茜和侯海鋒[20]的研究表明，單寧酸可影響小腸形態(tài)，使肉雞空腸的絨毛變長，隱窩深度下降，V/C 比值增大。

鼠類對含有單寧酸的食物具有一定的選擇能力[21]。在野外環(huán)境下，嚙齒動物會更喜食單寧酸含量高的食物[22]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，有些鼠類會更喜食單寧酸含量低的食物。如對東方田鼠(Microtus fortis)以及棕色田鼠(Lasiopodomys mandarinus)喂食含有不同濃度單寧酸的食物，兩種動物都會優(yōu)先選擇進食單寧酸含量低的食物[23-24]，因此不同嚙齒動物對含不同濃度單寧酸食物的選擇可能存在差異。

植物群落豐富度越高，動物的食物譜越廣，除了選擇取食含較低單寧酸的植物，還能夠通過攝入含不同次生代謝產(chǎn)物的植物來減少單寧酸對其的影響[25]。隨著海拔升高，草甸植物群落多樣性降低[26]，食草動物對食物的可選擇性降低。同時，在高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)中，多種植物單寧酸濃度隨著海拔升高而增加[27]。因此本研究選擇生活在高海拔地區(qū)的青海田鼠(Lasiopodomys fuscus)來探究單寧酸對其體重的影響以及青海田鼠對單寧酸的適應性。

青海田鼠是倉鼠科(Circetidae)田鼠屬動物，主要分布在青海、四川等地，棲息在海拔3 700～4 800 m的高寒草甸和草原[28]。通常青海田鼠很少取食含有較高單寧酸等次生代謝產(chǎn)物的植物[29]，但在食物匱乏的情況下，青海田鼠會攝食含高單寧酸的植物[30]。為探討高原小哺乳動物對單寧酸(TA)的適應機制，本研究以青海田鼠為研究對象，制備不同TA 含量的飼料，分析單寧酸對鼠類的體重和腸道結(jié)構(gòu)的影響，為探討單寧酸在高原動植物相互關(guān)系中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

2017 年8 月，在果洛州瑪沁縣青珍鄉(xiāng)(34°12′05′ N，100°05′16′′ E，海拔4 326 m)高寒草甸采用籠捕法捕獲24 只健康、成年雄性青海田鼠。帶回實驗室后，單籠飼養(yǎng)于中國科學院西北高原生物研究所動物 飼養(yǎng)房內(nèi)的450 mm × 289 mm × 180 mm 塑料籠內(nèi)，適應7 d，籠內(nèi)鋪有木屑，提供足量的水和食物。

1.2 試驗食物

將北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)的大小鼠生長全價顆粒飼料粉碎后，分別添加0、3%、6%含量的單寧酸(購自上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司)[29]，再使用飼料顆粒機加工成顆粒狀飼料，放置于低溫干燥處。

1.3 飼喂試驗

2019 年8 月25 日至10 月25 日，參考李俊年等[31]以及張賓[32]的方法，將體重相似的青海田鼠隨機分成3 組，每組8 只，分別用0 (對照組，CK)、3%和6%TA 處理的飼料連續(xù)喂食。在飼喂期間保持室內(nèi)溫度保持在(20 ± 3) ℃，定期清理糞便和墊料，避免交叉污染。分別在第7 天、第14 天、第28 天、第48 天和第60 天稱量青海田鼠的食物攝入量和體重變化。

采用Robbins[33]的公式計算試驗個體對TA 食物的攝入量，即：

食物攝入量 = 投入食物量 ? 剩余食物量。

1.4 樣品處理

在試驗第61 天將所有青海田鼠麻醉處死，取十二指腸、空腸、回腸中段的3～4 cm 腸管，迅速放置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于制作組織切片，測定小腸絨毛長度和隱窩深度。

1.5 測定指標

取下的腸道組織固定48 h 后，經(jīng)過水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋處理后，進行切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察小腸結(jié)構(gòu)，使用Motic Med 6.0 圖像軟件拍照，在視野下測量5 個最長腸絨毛處的絨毛長度和隱窩深度。

1.6 統(tǒng)計分析

采用混合線性效應模型分析單寧酸對青海田鼠體重變化或食物攝入量的影響，以處理前到處理后(0 ? 60 d)青海田鼠的體重或食物攝入量作為響應變量，單寧酸的濃度和時間作為固定效應，個體差異作為隨機效應(隨機截距)。模型分析的目標：1)響應變量隨時間的變化有無顯著差異；2)響應變量隨時間的變化在各組有無顯著差異。模型選擇的依據(jù)是響應變量體重與時間的變化趨勢：若響應變量與時間的變化趨勢是直線型，則時間變量設(shè)為連續(xù)性變量；若響應變量與時間的變化趨勢是無規(guī)律型，則時間變量設(shè)為分類型變量。將單寧酸的濃度0、3%和6%設(shè)為x1、x2和x3，響應變量為y；進食后若時間為連續(xù)型變量，將第 0 ? 60天表示為 t；若時間為分類型變量，將第 0、7、14、28、48、60 天分別表示為t1、t2、t3、t4、t5、t6。

根據(jù)以上假設(shè)，參考趙晉芳的研究[34]，構(gòu)建7 個模型，分別為：

式中：模型Ⅰ為空模型；模型Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ中的時間參數(shù)為連續(xù)型數(shù)據(jù)；模型Ⅳ、Ⅶ中的時間參數(shù)為分類型數(shù)據(jù)。

將模型Ⅰ至模型Ⅶ進行比較，使用對數(shù)似然比評估模型，通過AIC 信息準則進行模型選擇，根據(jù)ΔAIC 值進行排序，篩選出最優(yōu)模型[34-35]。

采用單因素方差分析探討單寧酸對小腸絨毛長度和隱窩深度的影響。使用R 3.4.3 中的lmer 程序包進行混合線性模型分析和模型選擇，使用emmeans程序包進行單個時間點的組間比較。

2 結(jié)果

2.1 模型選擇

模型選擇結(jié)果(表1)表明，單寧酸對青海田鼠體重的影響選擇模型Ⅶ；單寧酸對青海田鼠食物攝入量的影響選擇模型Ⅶ。

2.2 單寧酸對青海田鼠體重變化的影響

混合線性效應模型結(jié)果表明 (表2)，在單寧酸作用下，青海田鼠的體重隨著時間有顯著變化 (F =2.235，P = 0.015)，并且各組青海田鼠的體重隨著時間變化也有顯著差異 (F = 62.943，P ＜ 0.001)。試驗開始時，各組間體重無顯著差異 (P ＞ 0.05)；第7 天時，3% TA 處 理 組 的 體 重 顯 著 高 于 對 照 組 (P ＜0.05)，6% TA 處理組的青海田鼠的體重與對照組無顯著差異，表明剛開始時6% TA 對青海田鼠體重增加無抑制作用，3% TA 對體重增加產(chǎn)生促進作用；第14 天和第42 天時，3 組青海田鼠體重接近；第60 天時，6% TA 處理組的體重顯著高于對照組，表明青海田鼠對6% TA 在一段時間之后產(chǎn)生了適應性，6% TA 對其體重增加具有促進作用。

2.3 單寧酸對青海田鼠食物攝入量的影響

混合線性效應模型結(jié)果表明(表3)，在0、3%和6% TA 的處理下，青海田鼠的食物攝入量隨著時間有顯著變化(F = 5.949，P ＜ 0.001)；各組青海田鼠的食物攝入量，隨著時間的變化也有顯著差異(F =8.726，P = 0.003 67)。第7 天時，3% TA 處理組和對照組的青海田鼠食物攝入量分別下降了33.3%和24.2%，6% TA 處理組上升了63.6%，對照組與3% TA 處理組的食物攝入量差異顯著(P ＜ 0.05)，表明剛開始進食時，3% TA 對青海田鼠的食物攝入產(chǎn)生抑制作用；第14 天時，對照組與6% TA 處理組的青海田鼠的食物攝入量上升，3% TA 處理組的食物攝入量下降，3 個處理組間食物攝入量無顯著差異 (P ＞ 0.05)，但在第14 天之后，3%和6% TA 處理組的青海田鼠食物攝入量呈上升趨勢；第28 天至第60 天，3%處理組食物攝入量顯著高于對照組，表明在第14 天后青海田鼠對3% TA 產(chǎn)生適應性，TA 促進青海田鼠食物攝入量增加。

表1 混合線性效應模型選擇結(jié)果Table 1 Mixed linear effect model selection results

表2 單寧酸對青海田鼠體重變化的影響Table 2 Effects of tannic acid (TA) on body weight of Lasiopodomys fuscus g

表3 單寧酸對青海田鼠食物攝入量的影響Table 3 Effects of tannic acid (TA) on food intake of Lasiopodomys fuscus g

2.4 單寧酸對青海田鼠小腸絨毛和隱窩深度的影響

不同TA 處理組青海田鼠小腸絨毛長度有明顯差異(表4)。6% TA 處理組青海田鼠的小腸絨毛長度顯著長于對照組和3% TA 處理組(P ＜ 0.05)，3% TA處理組青海田鼠的小腸絨毛亦顯著長于對照組(P ＜0.05)，表明TA 對青海田鼠小腸絨毛生長具有促進作用。對照組的隱窩深度顯著低于3% TA 和 6%TA 處理組(P ＜ 0.001)，3% TA 處理組的隱窩深度與6% TA 處理組無顯著差異，表明TA 在一定程度上促進青海田鼠小腸隱窩深度的生長。絨毛長度/隱窩深度比(V/C)在3 組處理組中無顯著差異 (P ＞ 0.05)。

3 討論與結(jié)論

3.1 單寧酸與青海田鼠食物攝入量

動物體重變化與其能量代謝狀況密切相關(guān)。體重的維持和調(diào)節(jié)取決于能量攝入和消耗之間的平衡?；旌暇€性效應模型結(jié)果表明，隨著青海田鼠對單寧酸的適應，高濃度的單寧酸對青海田鼠的體重由抑制轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M作用，這與單寧酸對大林姬鼠(Apodemus speciosus)作用相似[36]。但如表2 所列，盡管不同處理組青海田鼠體重有顯著差異，但總體上青海田鼠體重是增加的。何嵐等[37]研究表明，含3%和6%單寧酸的飼料可顯著抑制東方田鼠體重增長，與本研究結(jié)果相反。

嚙齒動物的食性既受自身的遺傳性影響，也受生存環(huán)境的影響，是自然選擇和環(huán)境適應的結(jié)果。顧新州[38]對高原鼠兔食物選擇的研究結(jié)果顯示，生活在高海拔地區(qū)高原鼠兔的食物選擇會隨著棲息環(huán)境的變化，產(chǎn)生食性泛化。食性泛化是嚙齒動物對環(huán)境適應的結(jié)果，也是其能從不同植物中獲取更多營養(yǎng)所采取的策略。高海拔地區(qū)植被稀少，青海田鼠食物匱乏，對食物的選擇性更低[39]，雖然TA 對青海田鼠的體重有一定的負作用，但在能量需求條件下，為適應嚴酷環(huán)境，青海田鼠會做出改變食物選擇性和食物可利用率的決策。通過攝食的調(diào)節(jié)來協(xié)調(diào)消化、同化水平的變化，補償能量和營養(yǎng)的需求，使得青海田鼠能取食含較高濃度TA 的植物。

表4 單寧酸對青海田鼠絨毛長度和隱窩深度的影響Table 4 Effects of tannic acid (TA) on the villus length and crypt depth of Lasiopodomys fuscus

單寧類植物次生代謝產(chǎn)物對動物的影響因其活性對動物的生理狀況[16]、植物群落豐富度而不同[26]，動物的食物選擇對單寧酸的適應性亦有所不同[25]。試驗前期，TA 對青海田鼠食物攝入量具有一定的抑制作用，隨著時間的推移，抑制作用逐漸消失；試驗后期，青海田鼠適應了高濃度TA，TA 對青海田鼠食物攝入量增加起到促進作用。李俊年等[31]對根田鼠食物攝入量的研究顯示，在3%和6%單寧酸處理下，TA 對根田鼠食物攝入量產(chǎn)生抑制作用。單寧酸可通過與胃腸道內(nèi)的酶類結(jié)合，抑制酶類的功能，進而降低動物的食物攝入量[40]。TA 對青海田鼠食物攝入量的抑制作用下降，可能是由于青海田鼠對TA 的抑制作用產(chǎn)生了適應性[31]，同時TA 與唾液蛋白結(jié)合[41-42]，其中的脯氨酸能夠降低TA 的作用[43]。高濃度TA 能夠促進青海田鼠食物攝入量的增加，可能主要有兩個原因。一是，植物次生代謝產(chǎn)物可分為兩大類：有毒代謝產(chǎn)物和消耗減少代謝產(chǎn)物，前者導致食物攝入和排便減少，食物消化率增加；后者導致食物攝入和排便增加，食物消化率不變[44]。二是，植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對取食后的食草動物并不完全是負面作用的[45]。植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物不只是由于食草動物的取食，還可能是受到紫外線、強光、低溫、病原體入侵等因素誘導產(chǎn)生[46]。生長在青藏高原的植物，長期處于極端脅迫的環(huán)境中(如高海拔、低溫、強紫外線輻射等)，其酚類次生代謝物濃度較高[27]，青海田鼠適量采食含單寧酸的食物，有助于清除體內(nèi)的超氧化合物，避免其對細胞的損傷。Lin 等[30]研究也認為，高原鼢鼠挖掘等活動需要大量的能量，只能采食更多含有單寧酸的植物來滿足自身能量的需求。

3.2 單寧酸與動物小腸結(jié)構(gòu)

小腸的發(fā)育情況決定了腸道內(nèi)營養(yǎng)物消化吸收，小腸消化吸收功能受到腸絨毛、隱窩深度與黏膜厚度和絨毛表面積等的影響。小腸絨毛長度與小腸吸收功能相關(guān)，其長度影響動物的生長發(fā)育[47]。試驗結(jié)果顯示，單寧酸可以促進青海田鼠小腸絨毛的生長。Bozinovic 等[48]研究也證實南美洲栗鼠(Chinchilla brevicaudata)通過促進小腸的增長，來適應添加的TA。小腸隱窩深度與上皮細胞生成率有關(guān)[49]。當外界或動物體內(nèi)因素引起小腸上皮細胞生成率上升、隱窩深度變深，小腸會產(chǎn)生大量具有分泌功能的上皮細胞，引起動物的腹瀉[50]。本研究中TA 組小腸隱窩深度顯著高于對照組，表明TA 可加快小腸上皮細胞生長速率，增加隱窩深度。TA 到達動物腸道后可能改變腸上皮細胞的功能狀態(tài)，導致小腸營養(yǎng)吸收和利用受損[16]。食物添加縮合單寧酸也會導致大鼠腸粘液分泌過多和腸上皮細胞增殖增加[51]。動物小腸的吸收功能還和絨毛長度與隱窩深度的比值(V/C)有關(guān)[50]。V/C 值增加表明小腸吸收消化能力增強；反之亦然。從結(jié)果來看，3 個處理組的V/C 值無顯著差異，說明TA 并沒有通過改變小腸結(jié)構(gòu)影響其消化吸收能力。陳寶江等[52]研究提出，TA 對不同動物的影響存在顯著差別。茍昌勇等[53]的研究認為，TA 可通過增加腸道胰蛋白酶活性增強仔豬養(yǎng)分消化吸收。此外TA 還可以降低小腸食糜pH、增加養(yǎng)分溶解度，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[54-55]。TA 對青海田鼠的促生長作用機制尚不清楚，可能是通過影響消化酶、腸道微生物等方式來實現(xiàn)。

綜上，本研究討論了單寧酸對青海田鼠食物攝入量與小腸結(jié)構(gòu)的影響，研究結(jié)果表明，單寧酸會抑制青海田鼠進食，隨著時間推移，抑制作用降低，青海田鼠對單寧酸產(chǎn)生適應性后，單寧酸起到促進其進食的作用，但這一促進作用并不是通過改變小腸結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)的。