沈曉燕，劉曉瑜，邱海強

(無錫市藥品安全檢驗檢測中心，江蘇 無錫 214028)

感冒靈膠囊由三叉苦、金盞銀盤、野菊花、崗梅、對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏、咖啡因等組成的復(fù)方制劑，具有解熱鎮(zhèn)痛之功效，用于感冒引起的頭痛、發(fā)熱、鼻塞、流涕、咽痛等癥狀[1]。其中崗梅及野菊花的有效化學(xué)成分均含有綠原酸，野菊花中另一種有效成分為蒙花苷。其質(zhì)量標(biāo)準收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準中藥成方制劑第十三冊，原標(biāo)準中僅采用薄層色譜(TLC)法鑒別對乙酰氨基酚、馬來酸氯苯那敏及咖啡因，采用滴定的方法對乙酰氨基酚的含量進行控制，專屬性差、準確度低?！秶宜幤窐?biāo)準》WS3-B-2631-97-4中采用高效液相色譜(HPLC)法分3個系統(tǒng)分別對對乙酰氨基酚、咖啡因及馬來酸氯苯那敏含量進行測定，方法準確度提高，但是不夠快速簡便。為了完善其質(zhì)量標(biāo)準，筆者參考相關(guān)文獻[2-8]，建立HPLC法同時測定感冒靈膠囊中對乙酰氨基酚、綠原酸、咖啡因、馬來酸氯苯那敏及蒙花苷5種有效成分的含量。

本方法通過色譜條件的優(yōu)化，采用雙波長梯度洗脫的方式同時測定感冒靈膠囊中5種有效成分的含量，簡便快速，高效可行，為感冒靈膠囊的質(zhì)量控制提供了一個參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 Ⅱ高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；超聲清洗器(德國Elma公司)；電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；酸度計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試劑與藥品

1.2.1 對照品 綠原酸(批號：110753-201817，純度：96.8%，)、咖啡因(批號：171215-201211，純度：99.9%)、蒙花苷(批號：111528-201710，純度：96.6%)、對乙酰氨基酚(批號：100018-201610，純度：99.9%)、馬來酸氯苯那敏(批號：100047-201507，純度：99.7%)均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.2.2 供試品 市售感冒靈膠囊3批(廣西某藥業(yè)股份有限公司，批號：1711091、1910007、1909002)。

1.2.3 試劑 甲醇(HPLC級，默克公司)；冰醋酸(HPLC級，阿拉丁試劑)；三乙胺(HPLC級，阿拉丁試劑)；水為超純水。

2 試驗方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：甲醇-4%冰醋酸(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至3.0)，按表1梯度進行梯度洗脫；進樣量：10 μL；檢測波長：綠原酸與蒙花苷為334 nm，馬來酸氯苯那敏、對乙酰氨基酚與咖啡因為260 nm；柱溫：35 ℃。綠原酸、咖啡因、蒙花苷、馬來酸氯苯那敏和對乙酰氨基酚5個成分的峰理論板數(shù)均不低于3 000，與相鄰峰的分離度均大于2.0(見圖1)。

表1 梯度洗脫條件

A.混合對照溶液；B.供試品溶液；C陰性對照溶液 1.對乙酰氨基酚；2.綠原酸；3.咖啡因；4.馬來酸氯苯那敏；5.蒙花苷圖1 HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

2.2.1 貯備液 分別精密稱取綠原酸對照品10.55 mg，蒙花苷對照品10.65 mg置50 mL量瓶中，綠原酸量瓶中加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，蒙花苷量瓶中加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別量取上述溶液1.0 mL置15 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為綠原酸與蒙花苷對照品貯備液。

精密稱取咖啡因?qū)φ掌?0.30 mg、馬來酸氯苯那敏對照品10.46 mg置50 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取上述溶液各5.0 mL置15 mL量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別作為咖啡因與馬來酸氯苯那敏對照品貯備液。

精密稱取對乙酰氨基酚對照品51.72 mg，置25 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對乙酰氨基酚對照品貯備液。

2.2.2 混合對照溶液 量取“2.2.1”項下各對照品貯備液1.0 mL置同一10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為1.362 μg·mL-1綠原酸、4.496 μg·mL-1咖啡因、1.361 μg·mL-1蒙花苷、4.433 μg·mL-1馬來酸氯苯那敏、206.7 μg·mL-1對乙酰氨基酚的對照品混合溶液。

2.2.3 供試品溶液 取相同批號的感冒靈膠囊10粒，精密稱定，傾出內(nèi)容物，測得其平均裝量，研細，精密稱取細粉約0.1 g(約相當(dāng)于對乙酰氨基酚20 mg)置100 mL量瓶中，加50%的甲醇約50 mL超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷至室溫后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過即得。

2.2.4 陰性對照溶液 仿照感冒靈膠囊制劑制備處方，配制成不含對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏、崗梅和野菊花的陰性樣品，按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法制備陰性對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取綠原酸等5種成分對照品貯備液0.6、0.8、1.0、1.2、2.0、3.0 mL置10 mL量瓶中，照“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以樣品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準曲線，得到各線性回歸方程(見表2)。

表2 5種化學(xué)成分的線性方程(n=6)

2.4 檢出限和定量限 取“2.3”項下的低濃度對照品溶液，適當(dāng)稀釋后照“2.1” 項下色譜條件進樣測定。色譜圖見圖2。260 nm波長：信噪比(S/N)約為10∶1時，測得對乙酰氨基酚、咖啡因與馬來酸氯苯那敏的定量限分別為0.04、0.07與0.14 μg·mL-1，信噪比(S/N)約為3∶1時，測得其檢出限分別為0.01、0.03與0.06 μg·mL-1。334 nm波長：信噪比(S/N)約為10:1時，測得綠原酸與蒙花苷的定量限分別為0.03與0.08 μg·mL-1，信噪比(S/N)約為3∶1時，測得其檢出限分別為0.01與0.03 μg·mL-1。

A.對乙酰氨基酚；B.綠原酸；C.咖啡酸；D.馬來酸氯苯那敏；E.蒙花苷圖2 5種化學(xué)成分的定量限色譜圖

2.5 精密度試驗 精密量取“2.2.2” 項下對照品混合溶液，照“2.1” 項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算各色譜峰峰面積的RSD。對乙酰氨基酚、綠原酸、咖啡因、馬來酸氯苯那敏和蒙花苷的RSD分別為0.1%、0.9%、0.4%、0.5%和0.4%(n=6)。

2.6 重復(fù)性試驗 稱取“2.2.3” 項下細粉約0.1 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加50%的甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，并平行配置6份，照“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算各成分的含量。供試品中對乙酰氨基酚、綠原酸、咖啡因、馬來酸氯苯那敏和蒙花苷含量的RSD分別為0.7%、1.1%、0.7%、0.7%、0.1%(n=6)。說明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密量取“2.2.2” 項下對照品混合溶液，分別在0、1、2、4、6、8、12 h時照“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算各成分的峰面積的RSD值，對乙酰氨基酚、綠原酸、咖啡因、馬來酸氯苯那敏和蒙花苷峰面積的RSD分別為0.2%、0.5%、0.3%、0.5%、0.8%(n=7)。說明各成分對照品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取“2.2.3”項下細粉約0.1 g置100 mL量瓶中，精密加入低、中、高濃度的各成分對照貯備液(80%、100%、120%)，每個濃度各配置3份，照“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計算各成分的回收率，見表3～7。

表3 對乙酰氨基酚回收率

表4 綠原酸回收率

表5 咖啡因回收率

表6 馬來酸氯苯那敏回收率

表7 蒙花苷回收率

2.9 樣品測定 取3批感冒靈膠囊，照“2.2.3”項下制得供試品溶液，分別精密量取混合對照溶液與供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計算含量，測定結(jié)果見表8。

表8 樣品測定結(jié)果

3 結(jié)果與討論

3.1 測定波長的選擇 對綠原酸、咖啡因、蒙花苷、馬來酸氯苯那敏和對乙酰氨基酚進行紫外全波長掃描，綠原酸的最大吸收波長為324 nm，咖啡因的最大吸收波長為277 nm，蒙花苷的最大吸收波長為334 nm，馬來酸氯苯那敏的最大吸收波長為260 nm，對乙酰氨基酚的最大吸收波長為257 nm。馬來酸氯苯那敏在感冒靈膠囊中含量較低，故采用其最大吸收波長260 nm作為咖啡因、馬來酸氯苯那敏及對乙酰氨基酚的測定波長。綠原酸和蒙花苷與其他3個成分最大吸收波長相差較大，因此采用334 nm作為測定波長。

3.2 溶劑的選擇 由于蒙花苷在50%甲醇中的溶解度較差，首先選擇甲醇作為溶劑，照“2.1”項下色譜條件將供試品及對照品溶液進樣分析，結(jié)果各峰均呈現(xiàn)雙峰，考慮到溶劑效應(yīng)的影響，故將溶劑更換為50%的甲醇，進樣分析發(fā)現(xiàn)峰形有著明顯的改善，因此蒙花苷首先采用甲醇配置成一定濃度的貯備液，后續(xù)稀釋均采用50%的甲醇作為溶劑，其余4種成分均采用50%的甲醇作為溶劑。

3.3 流動相的選擇 首先采用甲醇-4%冰醋酸作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬來酸氯苯那敏峰拖尾較嚴重且與蒙花苷無法分離。因此，用三乙胺調(diào)節(jié)4%冰醋酸pH值至3.0，作為水相，有機相仍為甲醇進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬來酸氯苯那敏峰形有了明顯的改善，且與蒙花苷的分離度也符合要求，其余3個組分的峰形也較為理想，各組分間的分離度均符合要求。

3.4 耐用性考察 照”2.2.2”和”2.2.3”項下方法制備對照品溶液與供試品溶液,考察色譜條件(柱溫、流速、色譜柱)發(fā)生變動的情況下,樣品測定結(jié)果受影響的程度。柱溫的變化：分別在柱溫30、35和40 ℃條件下(其余色譜條件不變)進樣分析，結(jié)果表明，柱溫的變化僅對各色譜峰的保留時間略有影響，對測定結(jié)果無明顯影響。流速的變化：分別在流速0.8、1.0和1.2 mL·min-1條件下(其余色譜條件不變)進樣分析，結(jié)果表明，流速的變化僅對各色譜峰的保留時間及峰面積略有影響，對測定結(jié)果無明顯影響。色譜柱的變化：分別考察資生堂Capcell PAK MGII C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax Extend C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)及Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，結(jié)果表明，采用資生堂Capcell PAK MGII C18及Agilent Zorbax Extend C18色譜柱時需要微調(diào)流動相的比例馬來酸氯苯那敏與蒙花苷剛好能達到基線分離，而采用Waters XBridge C18色譜柱時兩者間的分離效果遠大于其余兩根，故選擇XBridge C18進行試驗分析。

感冒靈膠囊中含有精神藥品咖啡因，因此對咖啡因含量須嚴格控制。本方法中樣品的預(yù)處理易于操作，直接溶解、過濾后即可測定并且按本品的處方配制的陰性空白對照溶液在該色譜條件下無吸收，不影響待測組分的測定。本方法采用HPLC法同時測定感冒靈膠囊中對乙酰氨基酚、綠源酸、咖啡因、蒙花苷及馬來酸氯苯那敏的含量，方法快速簡便、準確可靠、重現(xiàn)性好，為本品的含量測定及質(zhì)量控制提供了可靠的依據(jù)。