劉盈，何嘉祺，顏秋燦，葉菲菲

(中山大學(xué)新華學(xué)院藥學(xué)院，廣東 廣州 510520)

金櫻子(RosalaevigataMickx.,RLM)屬薔薇科薔薇屬常綠蔓性灌木，主要藥效成分有氨基酸、多糖、黃酮類、三萜類物質(zhì)及其衍生物等[1-2]，其成熟果實(shí)可入藥，味酸、甘、澀，性平，有補(bǔ)血益精，澀腸止瀉之效，可增強(qiáng)免疫力、抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、保護(hù)腎臟、抗心律失常等藥理作用[2-3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，金櫻子果實(shí)中的水溶性多糖能夠消除陰離子自由基，減輕自由基對細(xì)胞膜的破壞引起的溶血[4]?，F(xiàn)代對金櫻子的化學(xué)成分和藥理作用研究雖多，其對人體表皮細(xì)胞抗衰老的相關(guān)研究卻甚少。本文以H2O2誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT cell)為模型，研究不同濃度金櫻子提取液對HaCaT細(xì)胞增殖與凋亡作用的影響，并探討其抗氧化損傷作用與藥物濃度的關(guān)系，為今后金櫻子在延緩皮膚衰老的研究進(jìn)程中提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT cell)細(xì)胞株購自美國ATCC公司。

1.1.2 藥材 金櫻子果實(shí)購自廣州市大參林藥房。

1.1.3 儀器與試劑 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海市貝侖儀器設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(青島海爾公司)；5%CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；-80 ℃低溫冰箱(美國Thermo公司)；酶熒光多功能檢測儀(美國Biotek公司)；細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Falon公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；冷凍干燥機(jī)(日本Eyela公司)；離心機(jī)(Beckman Coulter公司)。CCK-8試劑盒(美國Biosharp公司)；Hochest33342試劑(美國Sigma公司)；30%H2O2試劑(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；10%胎牛血清(德國PAN Biotech公司)；PBS粉末(博士德生物)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 金櫻子提取液的制備 將金櫻子干燥果實(shí)去核，刮核毛，打粉40目篩。在105 ℃烘箱中干燥10 min得粗粉備用。精密量取金櫻子粗粉20 g，置500 mL圓底燒瓶中，加200 mL蒸餾水加熱回流1 h。趁熱抽濾得濾液1備用；向裝有濾渣的燒瓶中加入150 mL蒸餾水，加熱回流40 min，趁熱抽濾得濾液2。合并濾液1與濾液2，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至膏狀備用。將濃縮后的提取液用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干處理，得到金櫻子提取物粉末。

1.2.2 H2O2誘導(dǎo)造模 CCK-8法篩選H2O2濃度的分組為：0、50、100、150、200、250、300 μmol·L-1，每組5個(gè)復(fù)孔。取培養(yǎng)好的HaCaT細(xì)胞，將原培養(yǎng)基吸出后分別加入對應(yīng)體積的0.03% H2O2溶液和DMEM培養(yǎng)基使每孔體積為200 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)作用2 h(損傷造模)。換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔分別加入5 μL CCK-8試劑作用3 h，充分染色后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測OD值。細(xì)胞存活率通過以下公式計(jì)算：

存活率(%)=(OD處理/OD空白)×100%[10]

1.2.3 CCK-8染色法測定細(xì)胞增殖水平 以“1.2.2”項(xiàng)下篩選出的H2O2最佳濃度為基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)分為空白組、H2O2損傷組、藥物預(yù)處理組。空白組給予完全培養(yǎng)基；H2O2損傷組加入H2O2溶液使體系終濃度為最佳損傷濃度；藥物預(yù)處理組分為5個(gè)濃度計(jì)量組：1、5、10、15、20 μg·mL-1。先按濃度加入金櫻子提取物作用預(yù)處理2 h，再加入最佳濃度的H2O2溶液作用2 h對HaCaT細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷。換培養(yǎng)基終止反應(yīng)后再在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育24 h，每孔分別加入5 μL CCK-8試劑作用3 h，充分染色后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測OD值。計(jì)算每孔中細(xì)胞存活率。

1.2.4 Hochest染色觀察細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)分為空白組、H2O2損傷組、藥物預(yù)處理組(10 μg·mL-1)。通過Hochest33342染色來觀察最佳H2O2濃度下氧化損傷后及經(jīng)過藥物預(yù)處理HaCaT細(xì)胞形態(tài)的變化及其凋亡情況。24孔板中的細(xì)胞經(jīng)預(yù)處理及培養(yǎng)后，使用PBS緩沖液反復(fù)清洗3次，加入Hochest33342試劑染色30 min。使用光學(xué)顯微鏡觀察，并拍照。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8染色法篩選H2O2氧化誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞最佳濃度 與空白組相比較，H2O2損傷組HaCaT細(xì)胞存活率(OD值)均有所下降，H2O2濃度100 μmol·L-1時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著H2O2濃度升高，細(xì)胞存活率下降的趨勢逐步變小，100 μmol·L-1H2O2為氧化損傷適宜濃度，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)損傷組中H2O2的加入量，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度H2O2對HaCaT細(xì)胞生長的影響

2.2 CCK-8測定細(xì)胞增殖水平 與空白組比較，H2O2損傷組HaCaT細(xì)胞存活率明顯降低，與H2O2損傷組比較，各濃度藥物保護(hù)組HaCaT細(xì)胞存活率明顯升高，隨金櫻子提取液濃度升高，細(xì)胞存活率逐漸增大，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明金櫻子提取液對氧化損傷后的HaCaT細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度金櫻子提取物對氧化損傷后細(xì)胞存活率的影響

2.3 Hochest染色觀察細(xì)胞凋亡情況 與空白組比較，H2O2損傷組細(xì)胞呈亮藍(lán)色，出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)聚集的現(xiàn)象，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，與H2O2損傷組比較，金櫻子提取液保護(hù)組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，表明金櫻子提取液對氧化損傷后的HaCaT細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用，結(jié)果見圖3。

A.空白組；B.H2O2處理組；C.金櫻子提取物作用組圖3 金櫻子提取物作用后HaCaT細(xì)胞凋亡情況

3 討論

近年來，隨著環(huán)境的惡化，皮膚健康問題越來越嚴(yán)重，各種因素都可以致使皮膚衰老，自由基氧化是引發(fā)皮膚衰老損傷的重要原因之一[5]。當(dāng)機(jī)體遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生過多，導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引起組織損傷，ROS 被認(rèn)為是造成氧化應(yīng)激的主要原因[6-7]，包括氧自由基和非自由基的含氧產(chǎn)物，如羥自由基(-OH)、超氧陰離子(O2-)、脂質(zhì)過氧化物(ROO-、 RO-與ROOH)及過氧化氫(H2O2)等[8]。金櫻子果實(shí)中的水溶性多糖和總黃酮均具有良好的抗氧化能力，能消除超氧陰離子自由基，減輕自由基對細(xì)胞膜的破壞而引起的溶血[4]。金櫻子總黃酮可通過抑制凋亡和炎癥反應(yīng)，防治H2O2的氧化損傷，也可顯著改善局部缺血再灌注造成的急性肝腎損傷[9]。H2O2易在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生超氧自由基，從而破壞生物膜，引起DNA突變，破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。有研究表明，H2O2能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使用低濃度的H2O2預(yù)處理后，細(xì)胞的凋亡率明顯增加[10]。體外H2O2能誘導(dǎo)并加速細(xì)胞因氧化應(yīng)激損傷所致的衰老進(jìn)程。因此，本研究以不同濃度的金櫻子提取液對HaCaT細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度金櫻子提取液預(yù)處理2 h后，其細(xì)胞活力(OD值)有顯著提高，隨濃度升高細(xì)胞活力增強(qiáng)，表明金櫻子提取液對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞具有一定的增殖作用，且在一定濃度范圍內(nèi)作用強(qiáng)度隨濃度升高而增大。Hochest染色法檢測金櫻子提取液對細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示H2O2損傷組較空白組出現(xiàn)更多的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞質(zhì)聚集等典型的細(xì)胞凋亡特征，在藥物保護(hù)組中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯減少，表明金櫻子提取液可以抑制經(jīng)H2O2氧化損傷造成的HaCaT細(xì)胞凋亡。綜上所述，金櫻子提取液對H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有一定的保護(hù)作用，其發(fā)揮抗氧化作用的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。