李思艷，劉俊蕃，李 梅

（浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院， 浙江 杭州 311300）

近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，碳納米管作為一種新型吸附劑被廣泛應(yīng)用于多種重金屬的去除[1-2]。碳納米管表面的羧基、羥基等官能團(tuán)與重金屬相互作用，提高了碳納米管對(duì)重金屬的吸附和選擇[3-7]，是影響碳納米管吸附重金屬的重要因素。除作為吸附劑使用外，碳納米管和重金屬在環(huán)境中共存時(shí)，也會(huì)影響重金屬的生態(tài)毒性。LIU等[8-9]發(fā)現(xiàn)：多壁碳納米管本身對(duì)斑馬魚Danio rerio沒有毒性，但卻由于吸附了鉛(Pb)和鋅(Zn)，加重了兩者在斑馬魚體內(nèi)的積累和毒性。MARTINEZ等[10]發(fā)現(xiàn)：硝酸氧化后的多壁碳納米管加劇了Pb在魚體中的累積。YU等[11]發(fā)現(xiàn)：表面未處理的多壁碳納米管會(huì)抑制大型蚤Daphnia magna對(duì)重金屬的吸收，而表面具有含氧官能團(tuán)的多壁碳納米管吸附了重金屬，由于“木馬效應(yīng)”，重金屬在大型蚤內(nèi)大量積累。與其他生物相比，微生物既是生態(tài)食物鏈的最底層也是分解者，因此微生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)更為重要。WANG等[12]發(fā)現(xiàn)：銅(Cu)和鉻(Cr)增強(qiáng)了碳納米管對(duì)微生物群落的影響。付勇等[13]對(duì)3種短多壁碳納米管和鎘離子(Cd2+)的復(fù)合細(xì)菌毒性進(jìn)行了初步研究，但未闡明不同官能團(tuán)對(duì)碳納米管吸附機(jī)制的影響[13]。在此基礎(chǔ)上，本研究以未經(jīng)修飾、羧基化、羥基化和氨基化多壁碳納米管為材料，通過Cd2+吸附平衡實(shí)驗(yàn)和細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)重金屬吸附及對(duì)大腸埃希菌Escherichia coli毒性的影響，從多壁碳納米管與重金屬相互作用角度揭示表面官能團(tuán)在多壁碳納米管影響重金屬細(xì)菌毒性中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

未經(jīng)修飾(MWCNTs)、羥基化(O-MWCNTs)、羧基化(C-MWCNTs)和氨基化多壁碳納米管(NMWCNTs)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度＞95%，內(nèi)徑為3～5 nm，外徑為8～15 nm，長(zhǎng)度約為50 μm。用超純水配制成1 000 mg·L-1的碳納米管懸液作為母液，使用前超聲分散15 min，并用超純水稀釋至所需質(zhì)量濃度。100 mg·L-1質(zhì)量濃度下，4種不同官能團(tuán)多壁碳納米管的zeta電位、含氧量、電導(dǎo)率和pH等參數(shù)見表1。

表1 不同官能團(tuán)多壁碳納米管的測(cè)定參數(shù)Table 1 Determination parameters of MWCNTs with different functional groups

用分析純四水硝酸鎘[Cd(NO3)2·4H2O]配制100 mg·L-1的Cd2+儲(chǔ)備液作為母液，使用前超純水稀釋至所需質(zhì)量濃度。以分離自生活污水的大腸埃希菌(Genbank收錄號(hào)：MG388227)為模型微生物，菌種保存于4 ℃冰箱中。使用前接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r·min-1在恒溫振蕩器中培養(yǎng)過夜，然后3 000 r·min-1離心制備菌懸液。為排除鹽度影響，細(xì)菌用超純水離心洗滌2次，利用紫外-可見分光光度計(jì)調(diào)節(jié)D(600)至1.0，菌落數(shù)量約為1×109CFU·mL-1。

1.2 方法

1.2.1 不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附 固定多壁碳納米管質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1，調(diào)節(jié)Cd2+質(zhì)量濃度為 0 (對(duì)照)、1、2、5、10 和 15 mg·L-1。150 r·min-1、25 ℃ 恒溫振蕩 3 h；4 000 r·min-1離心后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP，Prodigy7，利曼-徠伯斯公司，美國)測(cè)定濾液中Cd2+質(zhì)量濃度，計(jì)算平衡吸附量，繪制吸附等溫線。Langmuir吸附等溫式：q=qmKlc/1+Klc。其中：q為平衡吸附量(mg·g-1)，qm為單分子層飽和吸附量(mg·g-1)，Kl為平衡吸附常數(shù)，c為溶液中吸附質(zhì)平衡濃度(mg·g-1)。Freundlich吸附等溫式：q=Kfc1/n。其中：Kf為平衡吸附常數(shù)，n為常數(shù)。用Origin 9.0繪制吸附等溫線，分別用Langmuir和Freundlich吸附等溫式進(jìn)行曲線擬合，得到qm、Kl以及Kf和n。

1.2.2 細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn) 參考付勇等[13]、李梅等[14]進(jìn)行細(xì)菌毒性實(shí)驗(yàn)，采取染毒和生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法。量取Cd2+母液，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至0(對(duì)照)、1、2、4、8、10 mg·L-1，定容至9 mL。量取各官能團(tuán)多壁碳納米管懸液母液，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至0(對(duì)照)、10、20、50、100、200 mg·L-1，定容至9 mL。固定Cd2+質(zhì)量濃度至1 mg·L-1，分別加入0(對(duì)照)、10、20、50、100、200 mg·L-1的各官能團(tuán)多壁碳納米管懸液，定容至9 mL。往各樣品中加入1 mL細(xì)菌懸液[D(600)=1.0]，150 r·min-1、25 ℃恒溫培養(yǎng)3 h進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)。染毒結(jié)束后，取1 mL混合液轉(zhuǎn)移至9 mL滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測(cè)定混合液600 mn波長(zhǎng)處的吸光度[D(600)]。為避免顆粒沉降造成的影響，每次吸光度測(cè)定前樣品均先渦旋混合10 s。計(jì)算細(xì)菌存活率(%)：S=[D(600)t-s-D(600)o-s]/[D(600)t-c-D(600)o-c]。其中：D(600)o-c為對(duì)照組初始時(shí)刻600 nm下吸光度，D(600)t-c為對(duì)照組t時(shí)刻600 nm下吸光度，D(600)o-s為樣品組初始時(shí)刻600 nm下吸光度，D(600)t-s為樣品組t時(shí)刻600 nm下吸光度。根據(jù)對(duì)照組遲滯期長(zhǎng)短，t時(shí)刻選取2或3，各組取的t時(shí)刻與對(duì)照組相同。利用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì) Cd2+的吸附

25 ℃條件下不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附等溫線見圖1，Langmuir和Freundlich等溫式擬合參數(shù)見表2。從圖1可以看出：相同條件下，不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附能力大小依次為羧基化多壁碳納米管、羥基化多壁碳納米管、多壁碳納米管、氨基化多壁碳納米管。結(jié)合表2可知：4種多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附均可以用Langmuir和Freundlich方程較好地?cái)M合，其中羥基化和羧基化多壁碳納米管的Langmuir和Freundlich擬合相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到了0.95以上。對(duì)于未修飾的多壁碳納米管和氨基化多壁碳納米管，F(xiàn)reundlich方程擬合效果更好。

圖1 不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附等溫線Figure 1 Adsorption isotherm of Cd2+ on MWCNTs with different functional groups

Langmuir吸附等溫式適用于表面均勻吸附劑的吸附，可預(yù)測(cè)最大吸附量，擬合相關(guān)系數(shù)R2值越接近于1，預(yù)測(cè)得到的最大吸附量將越接近于真實(shí)值。Freundlich吸附等溫式適用于不均勻表面吸附劑的吸附，n值越小代表越難吸附。由表2可以看出：羧基化多壁碳納米管吸附量最大，是羥基化多壁碳納米管的約2倍，是未修飾多壁碳納米管的約4倍；Langmuir吸附等溫式擬合的氨基化多壁碳納米管吸附方程對(duì)應(yīng)的R2值偏低，其計(jì)算最大吸附量比實(shí)際值要大；平衡吸附常數(shù)的大小也在一定程度上代表了吸附劑的吸附性能，4種碳納米管的Freundlich平衡吸附常數(shù)Kf與其最大吸附量相一致，說明Freundlich吸附等溫式更適用于分析不同多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附。

表2 不同碳納米管對(duì) Cd2+的吸附等溫線方程擬合參數(shù)Table 2 Regression parameters of adsorption isotherms of Cd2+ onto different MWCNTs

2.2 不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+細(xì)菌毒性的影響

2.2.1 Cd2+對(duì)大腸埃希菌的毒性 由圖2可知：1 mg·L-1的Cd2+處理下，大腸埃希菌存活率約為70%；隨著Cd2+質(zhì)量濃度升高(10 mg·L-1)，大腸埃希菌存活率緩慢但持續(xù)下降(50%)。為減少因Cd2+質(zhì)量濃度變化對(duì)多壁碳納米管毒性實(shí)驗(yàn)的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中固定Cd2+質(zhì)量濃度為1 mg·L-1。

圖2 Cd2+的細(xì)菌毒性Figure 2 Bacterial toxicity of Cd2+

2.2.2 多壁碳納米管對(duì)大腸埃希菌的毒性 從圖3可知：與對(duì)照相比，質(zhì)量濃度不大于200 mg·L-1時(shí)，不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)大腸埃希菌存活不存在抑制作用，甚至不同程度提高了細(xì)菌的存活率，其中羧基化碳納米管對(duì)大腸埃希菌的存活最有利。

圖3 不同官能團(tuán)多壁碳納米管的細(xì)菌毒性Figure 3 Bacterial toxicity of MWCNTs with different functional groups

2.2.3 多壁碳納米管對(duì)Cd2+細(xì)菌毒性的影響 固定Cd2+質(zhì)量濃度為1 mg·L-1，考察不同質(zhì)量濃度的4種官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+大腸埃希菌毒性的影響。從圖4可以看出：隨著多壁碳納米管質(zhì)量濃度的增大，4種官能團(tuán)多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物處理下的大腸埃希菌存活率緩慢增加。與1 mg·L-1的Cd2+相比，當(dāng)復(fù)合物中多壁碳納米管質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí)，細(xì)菌存活率提高了11%(未修飾多壁碳納米管)～14%(羧基化多壁碳納米管)，可見4種官能團(tuán)多壁碳納米管均顯著降低了Cd2+的細(xì)菌毒性。

圖4 不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+細(xì)菌毒性的影響Figure 4 Effect of MWCNTs with different functional groups on toxicity of Cd2+ to E. coli

3 討論與結(jié)論

3.1 不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì) Cd2+的吸附機(jī)制

碳納米管對(duì)重金屬的吸附機(jī)制包括物理吸附、靜電引力、表面絡(luò)合、離子交換等[15]。通常認(rèn)為影響物理吸附的主要因素為吸附劑表面積，表面積越大，暴露的活性吸附點(diǎn)位也越多，吸附能力也越強(qiáng)[16]。本研究中4種多壁碳納米管管長(zhǎng)和管徑相同，物理吸附能力(有效吸附面積，即吸附點(diǎn)位)主要與其在水中的分散性能有關(guān)。未修飾多壁碳納米管和氨基化多壁碳納米管在水中易團(tuán)聚，羧基化和羥基化多壁碳納米管分散性能較好，因此對(duì)Cd2+的物理吸附性能優(yōu)于前兩者。碳納米管與Cd2+間的靜電引力主要取決于碳納米管的表面電荷。相較于其他3種多壁碳納米管，羧基化多壁碳納米管表面的羧基解離使－COOH變成了COO-，帶負(fù)電荷更多(表1)，與帶正電荷的Cd2+靜電吸引強(qiáng)，是羧基化多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附能力大的原因[17]。多壁碳納米管含氧官能團(tuán)對(duì)重金屬的吸附主要通過絡(luò)合作用[18-19]。XU等[20]發(fā)現(xiàn)：羧基化和羥基化多壁碳納米管都可與重金屬離子產(chǎn)生表面絡(luò)合作用。本研究發(fā)現(xiàn)：4種多壁碳納米管含氧量從大到小依次為羧基化多壁碳納米管、羥基化多壁碳納米管、多壁碳納米管、氨基化多壁碳納米管；結(jié)合圖1可知：多壁碳納米管含氧量越高，與Cd2+的反應(yīng)就越劇烈。本研究中未修飾的多壁碳納米管和氨基化多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附主要為物理吸附和靜電引力，而羥基化和羧基化多壁碳納米管吸附Cd2+主要為絡(luò)合作用，與羥基相比，羧基與Cd2+的化學(xué)鍵能更強(qiáng)，因而絡(luò)合反應(yīng)也更大，即羧基化多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附性能更好。

多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附?jīng)Q定了水中游離Cd2+的質(zhì)量濃度，一定程度上影響了Cd2+的生物可利用性。利用碳納米管對(duì)溶解Cd2+質(zhì)量濃度的影響可預(yù)測(cè)其對(duì)Cd2+細(xì)菌毒性的影響。若不考慮碳納米管與細(xì)菌的接觸，僅考慮Cd2+細(xì)菌毒性的變化，羧基化多壁碳納米管對(duì)Cd2+細(xì)菌毒性的降低最明顯，其次為羥基化多壁碳納米管，氨基化多壁碳納米管和未修飾的多壁碳納米管對(duì)重金屬細(xì)菌毒性影響較小。

3.2 不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+細(xì)菌毒性的影響分析

3.2.1 Cd2+對(duì)大腸埃希菌的毒性分析 超純水中Cd2+主要以游離態(tài)存在，其致毒機(jī)制主要為與大腸埃希菌表面上的吸附位點(diǎn)結(jié)合，通過離子通道等途徑進(jìn)入大腸埃希菌內(nèi)，并在某些特定部位富集[21]。實(shí)驗(yàn)室條件下，Cd2+細(xì)菌毒性隨Cd2+質(zhì)量濃度增大(1～10 mg·L-1)而增強(qiáng)，在菌落數(shù)為1×108CFU·mL-1時(shí)，大腸埃希菌存活率從70%降至50%左右。

3.2.2 不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)大腸埃希菌的毒性分析 目前認(rèn)為碳納米管與細(xì)菌直接接觸對(duì)細(xì)胞膜穿刺造成的物理損傷是碳納米管對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性的重要因素[22]。碳納米管與細(xì)菌是否能夠直接接觸不僅取決于碳納米管表面電荷，還取決于碳納米管質(zhì)量濃度及分散狀況。本研究中4種多壁碳納米管表面均帶負(fù)電荷，其中羧基化多壁碳納米管負(fù)電荷最多，因此與帶負(fù)電荷的細(xì)菌之間存在靜電斥力，不利于接觸。但羧基化多壁碳納米管和羥基化碳納米管分散性較好，與細(xì)菌接觸機(jī)會(huì)相對(duì)更多；未修飾多壁碳納米管和氨基化多壁碳納米管團(tuán)聚性較強(qiáng)，因團(tuán)聚而大部分沉降，與細(xì)菌接觸機(jī)會(huì)較少。同時(shí)多壁碳納米管外徑為8～15 nm，長(zhǎng)度約為50 μm，因接觸造成的物理損傷僅在細(xì)胞壁產(chǎn)生；因此可以認(rèn)為多壁碳納米管對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)沒有抑制。相反，羧基化多壁碳納米管存在條件下，細(xì)菌存活率提高；這是由于細(xì)菌正常生長(zhǎng)需要適合的滲透壓，等滲條件下細(xì)菌抗毒能力強(qiáng)，低于等滲離子強(qiáng)度時(shí)，離子強(qiáng)度越大，細(xì)菌存活率越高[23]。為排除離子強(qiáng)度對(duì)碳納米管影響，本研究利用超純水為背景介質(zhì)，100 mg·L-1質(zhì)量濃度下，羧基化多壁碳納米管電導(dǎo)率最高，表面負(fù)電荷最多，與細(xì)菌的靜電斥力更強(qiáng)，因此羧基化多壁碳納米管存在條件下，細(xì)菌存活率明顯高于其他處理。

3.2.3 多壁碳納米管對(duì)Cd2+毒性的影響分析 多壁碳納米管對(duì)Cd2+毒性的影響可以從3個(gè)方面來解釋。①多壁碳納米管的毒性。多壁碳納米管吸附Cd2+后，表面負(fù)電荷均被中和，顆粒自團(tuán)聚和顆粒與細(xì)菌間的異團(tuán)聚性能均增加，2種團(tuán)聚對(duì)細(xì)菌的毒性影響相反，因此多壁碳納米管吸附Cd2+前后自身毒性變化可以忽略。②游離態(tài)Cd2+的毒性。游離態(tài)Cd2+質(zhì)量濃度受到多壁碳納米管類型與質(zhì)量濃度的影響[24]。對(duì)4種多壁碳納米管的吸附等溫?cái)M合發(fā)現(xiàn)：同等初始質(zhì)量濃度時(shí)，不同官能團(tuán)多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附能力從大到小依次為羧基化多壁碳納米管、羥基化多壁碳納米管、多壁碳納米管、氨基化多壁碳納米管，而由游離態(tài)Cd2+造成的細(xì)菌毒性與其質(zhì)量濃度一致。③多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物的毒性。除游離態(tài)Cd2+外，體系中存在的多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物也可能會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性[13]。多壁碳納米管吸附Cd2+后表面負(fù)電荷降低，導(dǎo)致多壁碳納米管與細(xì)菌的接觸機(jī)會(huì)增加，此時(shí)，與多壁碳納米管結(jié)合能力弱的Cd2+將可能轉(zhuǎn)移至細(xì)菌表面對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷。另外，其物理損傷將會(huì)促進(jìn)Cd2+進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生傷害[25-26]。未修飾多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物與氨基化多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物對(duì)細(xì)菌的毒性不能忽略。總體上多壁碳納米管吸附Cd2+造成的毒性降低大于多壁碳納米管與細(xì)菌直接接觸造成的毒性增強(qiáng)，因此表現(xiàn)為多壁碳納米管可降低環(huán)境Cd2+的細(xì)菌毒性。

3.3 結(jié)論

多壁碳納米管內(nèi)外管徑及長(zhǎng)度均相同時(shí)，多壁碳納米管吸附Cd2+性能與其表面官能團(tuán)含氧量有關(guān)，含氧量越高，吸附能力越強(qiáng)。即4種多壁碳納米管對(duì)Cd2+質(zhì)量濃度降低程度從高到低依次為羧基化多壁碳納米管、羥基化多壁碳納米管、多壁碳納米管、氨基化多壁碳納米管。4種多壁碳納米管對(duì)Cd2+的吸附在不同程度上降低Cd2+生物有效性，同時(shí)碳納米管-Cd2+復(fù)合物也存在一定毒性，總體上多壁碳納米管質(zhì)量濃度越高，對(duì)Cd2+細(xì)菌毒性降低越顯著，相比之下，羧基化多壁碳納米管表現(xiàn)了更強(qiáng)的降毒能力。