趙 凱，常志芳，王志華，龐春艷，王永福

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古自治區(qū)自體免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古包頭 014010)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid anhritis，RA)是一種累及免疫系統(tǒng)的疾病，通常以滑膜炎為主要病理改變，以慢性關(guān)節(jié)炎為主要臨床特點(diǎn)[1]。RA患者的血清中包含多種自身抗體，瓜氨酸存在與這些抗體識別的表位[2]。肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deaminase 4，PAD4)可以在鈣離子存在的環(huán)境中使精氨酸殘基脫去亞氨基，從而生成瓜氨酸化蛋白[3]，該蛋白與RA發(fā)病機(jī)制有關(guān)。研究顯示，PAD4的活性失調(diào)與 RA 疾病的發(fā)生與發(fā)展存在一定的聯(lián)系[4]。人體的免疫系統(tǒng)又將瓜氨酸化蛋白定義為外來物質(zhì)，最終發(fā)生自身免疫反應(yīng)，引起 RA 的發(fā)生與發(fā)展。RA 患者體內(nèi)的自身抗體可以識別瓜氨酸化蛋白，人體內(nèi)瓜氨酸化蛋白的程度與RA 的疾病進(jìn)展直接相關(guān)，而PAD4則被認(rèn)為是RA治療藥物研究的一個(gè)新靶酶。

RA患者體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，可導(dǎo)致多種并發(fā)癥的出現(xiàn)，而肺最容易受累。間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease，ILD)是RA關(guān)節(jié)外并發(fā)癥中最常見的疾病，可有肺實(shí)質(zhì)的彌漫性改變、肺泡炎癥，以及間質(zhì)纖維化的病理改變，經(jīng)常導(dǎo)致較高的發(fā)病率和病死率。當(dāng)RA患者肺部出現(xiàn)并發(fā)癥時(shí)常會產(chǎn)生瓜氨酸化蛋白，從而引起免疫反應(yīng)生成相應(yīng)的抗瓜氨酸化蛋白抗體。而PAD4可催化瓜氨酸化，導(dǎo)致RA的進(jìn)展，可能與ILD的發(fā)病有一定的相關(guān)性。瓜氨酸化,在RA細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均呈現(xiàn)的是失調(diào)狀態(tài)，在嗜中性粒細(xì)胞中，穿孔素、膜攻擊復(fù)合物、細(xì)菌產(chǎn)生的毒素可誘導(dǎo)PAD的鈣離子內(nèi)流、細(xì)胞溶解和過度活化。這些因素可能分別驅(qū)動RA關(guān)節(jié)外臟器的過度纖維化[5]。因此，本研究旨在針對基因PAD4設(shè)計(jì)3段 siRNA序列，同時(shí)建立CIA小鼠模型，將3段siRNA尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，觀察其對CIA小鼠肺間質(zhì)病變的治療作用及其機(jī)制，為PAD4-siRNA對RA的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)研究對象

6～8周齡的DBA/1小鼠，雄性，購于南京大學(xué)動物模式研究所，動物批號為N000219。

1.2 試劑及儀器

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自ThermoFisher(中國)公司，磷酸緩沖液購自美國Gibco公司，紅細(xì)胞裂解液購自日本Takara公司，澳洲源優(yōu)級胎牛血清購自美國Gibco公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自生工生物工程(上海)股份有限公司，完全弗氏佐劑、牛 Ⅱ 型膠原購自美國Chondrex公司，APC-Foxp3、PE-CXCR5、FITC-CD4購自美國Abcam公司，熒光定量PCR儀購自中國BIOER公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1針對基因PAD4設(shè)計(jì)3段 siRNA序列并構(gòu)建腺病毒載體 使用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件根據(jù)其設(shè)計(jì)原則，依據(jù)小鼠基因 PAD4 cDNA序列設(shè)計(jì)3段 siRNA序列，送上海吉凱公司合成并構(gòu)建腺病毒載體，經(jīng)基因測序鑒定，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞制備病毒，流式細(xì)胞儀鑒定病毒滴度。

1.3.2建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型 6～8周齡的DBA/1小鼠，雄性，40只，將牛Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑混和并充分乳化，牛Ⅱ型膠原(質(zhì)量)濃度為2 g/L(mg/mL)，完全弗氏佐劑的(質(zhì)量)濃度為5 g/L，于DBA/l小鼠尾根部皮內(nèi)注射上述乳化好的膠原進(jìn)行初次免疫。21 d后使用同樣方法進(jìn)行再次免疫。35 d后DBA/1小鼠的爪出現(xiàn)紅腫，即CIA小鼠的模型已經(jīng)建立。

1.3.3腺病毒尾靜脈注射 實(shí)驗(yàn)分6組，每組4只。(1)空白組：沒有進(jìn)行任何處理的小鼠；(2)模型組：CIA造模成功后沒有進(jìn)行任何治療；(3)陰性對照組：CIA造模成功后注射感染陰性病毒液；(4)PAD4-siRNA1組：CIA造模成功后注射PAD4-siRNA1病毒液；(5)PAD4-siRNA2組：CIA造模成功后，注射PADA4-siRNA2病毒液；(6)PAD4-siRNA3組：CIA造模成功后，注射PAD4-siRNA3病毒液。(3)～(6)組小鼠注射100 μL/只，每周1次，共8次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠。

1.3.4小鼠肺PAD4 mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測 取肺，使用Trizol提取肺中RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測PAD4 mRNA的表達(dá)水平，對切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測PAD4 蛋白的表達(dá)位置和表達(dá)水平。

1.3.5小鼠脾細(xì)胞中Tfh細(xì)胞和Tfr細(xì)胞的檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，處死小鼠，無菌條件下取脾，PBS洗滌，研磨，細(xì)胞篩過濾，1 000 r/min 離心5 min，將細(xì)胞懸液移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加5 mL含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)的完全培養(yǎng)基RPMI-1640，加PMA/Ionomycin混合物和BFA/ Monensin混合物，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，5% (體積分?jǐn)?shù))CO2，37 ℃培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3.6小鼠肺PAD4病理學(xué)觀察 小鼠肺組織切片進(jìn)行HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，Levene法檢驗(yàn)，方差齊的數(shù)據(jù)采用LSD法，方差不齊的數(shù)據(jù)采用Tamhane’s法；兩組間比較采用t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAD4-siRNA治療后小鼠肺中PAD4 mRNA的表達(dá)

模型組與空白對照組小鼠比較，PAD4 mRNA的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.97±1.47vs. 1.00±0.00，P<0.05)；PAD4-siRNA治療后CIA小鼠肺PAD4 mRNA的表達(dá)水平較模型組和陰性對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 PAD4-siRNA治療后小鼠肺PAD4蛋白的表達(dá)

空白組小鼠肺組織中紅色熒光較少，而模型組和陰性對照組小鼠肺組織的炎細(xì)胞浸潤區(qū)和氣管周圍可見較多的紅色熒光，PAD4-siRNA治療后3組的紅色熒光明顯減少，即CIA小鼠的肺組織可見PAD4的高表達(dá)，并且PAD4蛋白多表達(dá)于炎性細(xì)胞浸潤區(qū)和氣管周圍，而采用PAD4-siRNA治療后小鼠肺中PAD4的表達(dá)水平降低(圖1)。

A, blank group; B, model group; C, negative control group; D, PAD4-siRNA1 group; E, PAD4-siRNA2 group; F, PAD4-siRNA3 group.圖1 小鼠肺中PAD4蛋白的表達(dá)Figure 1 The PAD4 protein expression in the lungs of CIA mouse

2.3 PAD4-siRNA治療后小鼠脾細(xì)胞中Tfh細(xì)胞的比例

模型組小鼠脾細(xì)胞中的Tfh細(xì)胞比例明顯增加，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；而治療后的小鼠脾細(xì)胞中的Tfh細(xì)胞比例較模型組和陰性對照組明顯降低(P<0.05，圖2)。

A, blank group; B, model group; C, negative control group; D, PAD4-siRNA1 group; E, PAD4-siRNA2 group; F, PAD4-siRNA3 group.*P<0.05.圖2 小鼠脾細(xì)胞中Tfh細(xì)胞的比例Figure 2 The proportion of Tfh cells in splenocytes of CIA mouse

2.4 PAD4-siRNA治療后小鼠脾細(xì)胞中Tfr細(xì)胞的比例

模型組小鼠脾細(xì)胞中的Tfr細(xì)胞比例明顯降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；治療后小鼠脾細(xì)胞中的Tfr細(xì)胞比例較模型組和陰性對照組明顯增加，但只有PAD4-siRNA2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

A, blank group; B, model group; C, negative control group; D, PAD4-siRNA1 group; E, PAD4-siRNA2 group; F, PAD4-siRNA3 group.*P<0.05.圖3 小鼠脾細(xì)胞中Tfr細(xì)胞的比例Figure 3 The proportion of Tfr cells in splenocytes of CIA mouse

2.5 PAD4-siRNA治療后小鼠脾細(xì)胞中Tfh/Tfr值的變化

模型組小鼠脾細(xì)胞中的Tfh/Tfr值明顯增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PAD4-siRNA治療后小鼠脾細(xì)胞中的Tfh/Tfr值較模型組和陰性對照組明顯降低(P<0.05,圖4)。

A, blank group; B, model group; C, negative control group; D, PAD4-siRNA1 group; E, PAD4-siRNA2 group; F, PAD4-siRNA3 group.*P<0.05.圖4 小鼠脾細(xì)胞中Tfh/Tfr值的變化Figure 4 The changes of Tfh/Tfr cells in splenocytes of CIA mouse

2.6 PAD4-siRNA治療后小鼠肺的病理改變

空白組小鼠肺的肺泡壁及氣管結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤，未見間質(zhì)纖維組織形成；而模型組小鼠肺中可見肺結(jié)構(gòu)紊亂，正常肺泡明顯減少，肺泡變形及間隔增寬，血管壁可見炎性細(xì)胞浸潤，肺組織廣泛纖維化；而治療后的3組小鼠與模型組和陰性對照組比較，可見肺結(jié)構(gòu)紊亂減少，炎性細(xì)胞浸潤降低，肺泡壁破壞減少,以及間質(zhì)纖維化程度降低(圖5)。

A, blank group; B, model group; C, negative control group; D, PAD4-siRNA1 group; E, PAD4-siRNA2 group; F, PAD4-siRNA3 group.圖5 小鼠肺的組織病理學(xué)改變Figure 5 The pathological changes in the lungs of CIA mouse

3 討論

RA是一種慢性炎癥性關(guān)節(jié)病，通?？梢疖浌呛凸菗p傷，RA又是全身慢性自身免疫性疾病，全身多臟器都可累及，以肺累及最明顯。

肺部受累是RA的常見關(guān)節(jié)外特征，累及肺時(shí)臨床表現(xiàn)多樣，包括胸膜炎、胸腔積液以及氣道疾病，常見的臨床表現(xiàn)有閉塞性細(xì)支氣管炎、類風(fēng)濕結(jié)節(jié)以及ILD[6]。研究者在觀察CIA大鼠模型肺不同時(shí)間的病理變化時(shí)發(fā)現(xiàn)CIA大鼠肺受累經(jīng)歷了從肺泡炎至間質(zhì)性肺病的過程，證明RA發(fā)展過程中肺受累可導(dǎo)致其肺泡和肺間質(zhì)的改變[7]。Darrah等[8]研究發(fā)現(xiàn)PAD4是RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵酶，并且抗PAD4抗體與嚴(yán)重的關(guān)節(jié)病變和肺病變相關(guān)。PAD4的活性失調(diào)與 RA 疾病的發(fā)生與發(fā)展存在一定的聯(lián)系，抗PAD4自身抗體可能是RA中重要的生物標(biāo)志物。本課題組前期的研究(另文發(fā)表)中也發(fā)現(xiàn)CIA小鼠除了有明顯的關(guān)節(jié)病變外，肺會出現(xiàn)間質(zhì)病變。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3段PAD4-siRNA尾靜脈注射CIA小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CIA小鼠的肺中PAD4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高，且PAD4蛋白多表達(dá)于炎性細(xì)胞浸潤區(qū)和氣管周圍，采用siRNA技術(shù)沉默PAD4的表達(dá)后，CIA小鼠肺組織中PAD4 mRNA和蛋白的表達(dá)水平降低。CIA小鼠肺組織可見肺結(jié)構(gòu)紊亂，正常肺泡明顯減少，肺泡變形及間隔增寬，血管壁可見炎性細(xì)胞浸潤，肺組織廣泛纖維化，PAD4-siRNA治療后CIA小鼠肺組織的病理改變減輕，炎性細(xì)胞浸潤降低，肺泡壁破壞減少以及間質(zhì)纖維化程度降低，提示PAD4確實(shí)參與了CIA小鼠肺間質(zhì)病變的發(fā)生，CIA小鼠引起關(guān)節(jié)病變的同時(shí)確實(shí)可導(dǎo)致肺間質(zhì)病變的發(fā)生，而PAD4-siRNA可以減輕這種肺間質(zhì)病變的程度。

RA疾病的進(jìn)展是免疫細(xì)胞相互作用的結(jié)果，Tfr與Tfh這兩種細(xì)胞在RA的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要的作用[9]。Tfh細(xì)胞輔助 B淋巴細(xì)胞在自身免疫疾病中發(fā)揮核心作用，而Tfr控制生發(fā)中心中Tfh和B細(xì)胞的過度活化[10]，Tfh和Tfr自身的改變以及二者比例的失衡都會導(dǎo)致RA的發(fā)展。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，RA患者的Tfh和Tfr細(xì)胞比健康人群均增加。更重要的是，Tfr / Tfh值降低，表明Tfh和Tfr之間的平衡被破壞[12]。本研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠脾細(xì)胞中Tfh細(xì)胞的比例升高、Tfr細(xì)胞的比例明顯降低、Tfh/Tfr值明顯增高，而經(jīng)過PAD4-siRNA治療后的小鼠Tfh細(xì)胞比例下降、Tfr含量升高、Tfh/Tfr值明顯降低，這些結(jié)果表明Tfh和Tfr細(xì)胞均參與了CIA小鼠的發(fā)病，而PAD4-siRNA沉默PAD4的表達(dá)后，可抑制Tfh細(xì)胞的產(chǎn)生、促進(jìn)Tfr細(xì)胞的生成、逆轉(zhuǎn)Tfh/Tfr的比例，進(jìn)而發(fā)揮治療CIA小鼠肺間質(zhì)病變的作用。

綜上所述，CIA小鼠發(fā)病的過程會導(dǎo)致肺的病理改變，PAD4-siRNA沉默其mRNA和蛋白的表達(dá)后，可以通過調(diào)節(jié)Tfh和Tfr細(xì)胞的比例(平衡)而發(fā)揮治療肺間質(zhì)病變的作用。