白 楓，何倚帆，牛亞楠，楊若娟，曹 靜

(山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，太原 030001)

超細(xì)顆粒物(ultrafine particulates，UFPs)是指空氣動力學(xué)直徑<0.1μm的微粒，占所有顆粒物的84%[1]。UFPs體積小且表面積大，在空氣中停留時(shí)間長，攜帶更多有毒物質(zhì)，對健康危害更大。近年來，超細(xì)顆粒物對心血管疾病的危害受到廣泛關(guān)注。研究表明，超細(xì)顆粒物短期暴露可引起心率變異性降低[2-3]，ST段壓低，缺血負(fù)擔(dān)顯著增加[4]，動脈順應(yīng)性和內(nèi)皮依賴性血管舒張功能降低等血管舒縮性變化[5-6]，同時(shí)機(jī)體氧化應(yīng)激標(biāo)志物增加[6]，凝血風(fēng)險(xiǎn)增高和血小板活化增強(qiáng)[7]，血漿纖維蛋白原和調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞升高[8]，增加冠心病患者的發(fā)病率和病死率[9]。然而，UFPs對心臟毒性的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究采用Langendorff離體心臟灌流技術(shù)，在離體心臟水平研究UFPs短期暴露對心功能的影響，并探討其產(chǎn)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(3～4月齡，體質(zhì)量200～220 g)，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號SCXK晉2009-0001)。所有用于研究的動物遵照《國家實(shí)驗(yàn)室動物健康管理與使用指南》，所有施與動物的操作都經(jīng)過山西醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批批準(zhǔn)。將20只大鼠隨機(jī)分為2組，分別用含或不含UFPs成分的臺式液灌注離體心臟。

1.1.2主要材料與儀器 顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品SRM 2975購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)，4 ℃保存；GL-2 Langendorff 離體心臟灌流裝置、PT-100 生物壓力傳感器、BL-420E 生物信號采集分析系統(tǒng)購自成都泰盟科技有限公司；微量丙二醛、超氧化物歧化酶、總抗氧化物能力試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；一抗p38 MAPK(D13E1)XP? Rabbit mAb #8690、一抗Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(D3F9)XP? Rabbit mAb #4511、一抗p44/42 MAPK(ERKs)、一抗Phospho-p44/42 MAPK(ERKs)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E)XP? Rabbit mAb #4370均購自美國cellsignal公司；一抗JNKs sc-572和一抗p-JNKs sc-135642均購自美國Santa Cruz公司；二抗HRP標(biāo)記的anti-Rabbit IgG購自北京中杉金橋有限公司。

1.2 方法

1.2.1超細(xì)顆粒物的準(zhǔn)備 研究方案參照Sun等[10]的實(shí)驗(yàn)過程，并在其基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，購買的SRM 2975 12.5 mg溶于100 mL臺式液，室溫?cái)嚢?0 min，充分超聲震蕩，先后用1 μm孔徑的玻璃纖維過濾器和0.1 μm圓柱形孔隙聚碳酸酯膜過濾，所得濾液稀釋至1 L臺式液即終(質(zhì)量)濃度為12.5 mg/L，用于灌注大鼠離體心臟。

1.2.2離體心臟灌流模型的制備 經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉SD大鼠，打開胸腔，沿脊柱胸主動脈分離心臟，取出心臟后立即置于預(yù)冷的臺式液，輕輕擠壓心臟和動脈內(nèi)殘留的血液，迅速在Langendorff裝置上經(jīng)過主動脈根部插管[10]，逆行灌注預(yù)先加溫且充氧氣的臺式液。灌流數(shù)秒，待心臟恢復(fù)節(jié)律性跳動，打開左心耳，剪一小切口，將聚氯乙烯膜制成的扁球囊經(jīng)此切口插入左心室；球囊提前排凈空氣，連接充滿水的不銹鋼導(dǎo)管，通過連接在導(dǎo)管上的活塞注射器向球囊注入液體，使球囊與液體均勻接觸，連接壓力傳感器；操作活塞注射器使球囊充水，舒張壓保持在8～12 mmHg，各項(xiàng)血流動力學(xué)參數(shù)通過BL-420E生物信號采集分析系統(tǒng)進(jìn)行記錄和分析，記錄生理參數(shù)包括心率、左心室舒張壓(left ventricular developed pressure,LVDP)、+dp/dtmax、-dp/dtmax。LVDP等于左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)和左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)的差值。基線水平LVDP≥70 mmHg的心臟方可入組進(jìn)行研究[10]。分離肺動脈，剪開肺動脈口，以收集心臟穩(wěn)定跳動時(shí)每分肺動脈的流出物來計(jì)算冠脈流量(coronary flow, CF)。

1.2.3大鼠離體心臟血流動力學(xué)參數(shù)及CF測定 心臟平穩(wěn)跳動約15 min，各項(xiàng)指標(biāo)相對平穩(wěn)后，通過外接電極將心率固定在高于固有心率約10%的水平[10]，開始實(shí)驗(yàn)。正常組記錄給予正常臺式液時(shí)心臟血流動力學(xué)參數(shù)LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及CF的數(shù)值，觀察約40 min。UFPs灌流組待離體心臟各項(xiàng)生理指標(biāo)穩(wěn)定且記錄后，改用含有12.5 mg/L UFPs的臺式液灌流心臟，觀察UFPs干預(yù)后心臟血流動力學(xué)各參數(shù)及CF的變化，各項(xiàng)指標(biāo)每10 min記錄1次。

1.2.4肺動脈流出液氧化應(yīng)激水平的測定 收集兩組肺動脈流出液，采用硫代巴比妥酸TBA法測定丙二醛(malondialdetioxidant, MDA)， 水溶性四唑鹽WST-1法測定超氧化物歧化酶(superoxide dismatase, SOD)， 比色法測定總抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAOC)， 所有檢測重復(fù)3次，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5大鼠心臟組織病理學(xué)改變 灌流結(jié)束，取部分心肌組織，4%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，乙醇脫水，烘干，中性樹膠封片。

1.2.6免疫組織化學(xué)法檢測大鼠離體心臟p-p38 MAPK、p-ERKs、p-JNKs的表達(dá) 采用Envision法對心臟離體組織進(jìn)行免疫學(xué)檢測，將兩組石蠟包埋的心臟組織切成5 μm厚切片，放置于多聚賴氨酸覆蓋的切片上，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。組織切片在pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液95～100℃孵育20 min，水浴恢復(fù)抗原。組織切片和p-p38 MAPK、p-ERKs、p-JNKs一抗(1 ∶500)孵育，濕盒4 ℃過夜，二抗孵育，蘇木素復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯清洗，以中性樹膠封片。

1.2.7Western blots檢測大鼠離體心臟p-p38 MAPK、p-ERKs、p-JNKs的表達(dá) 灌流結(jié)束，取心肌組織100 mg，常規(guī)提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。在12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的SDS-PAGE中每孔加入20 μL蛋白溶液，以80 V、30 min及120 V、1 h進(jìn)行電泳分離；電泳結(jié)束，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST(Tris-buffered saline and Tween 20)溶液搖床上室溫封閉2 h，加入兔抗大鼠p-p38 MAPK及p38 MAPK一抗(1 ∶1 000)、p-ERKs 及ERKs一抗(1 ∶1 000)、p-JNKs及JNKs一抗(1 ∶200)4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，加入羊抗兔二抗(1 ∶2 000)孵育1 h，再以TBST漂洗3次，每次10 min，加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液750 μL，室溫孵育2 min，美國Bio-Rad全自動曝光儀掃描，Alpha View生物電泳圖象分析軟件測定Western blots圖像中各條帶的光密度值，以目的蛋白條帶與相應(yīng)內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism Software Version 6.0和SAS軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，離體心臟心功能指標(biāo)采用具有一個重復(fù)測量的兩因素設(shè)計(jì)的方差分析；兩組氧化應(yīng)激和MAPK表達(dá)數(shù)據(jù)的比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UFPs灌注惡化大鼠離體心臟功能

正常臺式液灌流組大鼠離體心臟血流動力學(xué)參數(shù)各指標(biāo)及CF無明顯變化；含UFPs的臺式液灌流大鼠離體心臟，血流動力學(xué)參數(shù)包括LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax及CF明顯惡化，分別從初始值(82.6 ± 2.1) mmHg、(1 624 ± 113) mmHg/s、(1 565 ± 116) mmHg/s、(12.0 ± 0.2) mL/min降至灌流結(jié)束時(shí)(56.8 ± 4.4) mmHg、(1 066 ± 177) mmHg/s、(1 082 ± 134) mmHg/s、(8.7 ± 0.3) mL/min，各指標(biāo)下降相比初始值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，下降率分別約31.2%、34.5%、30.8%、27.5%。組間比較提示UFPs組灌注30、40 min，較正常組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)心臟功能各指標(biāo)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以正常組初始值各指標(biāo)為100%，計(jì)算兩組灌注時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)變化的百分比，灌注結(jié)束時(shí)，正常組LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、CF分別為99%、106%、105%、100%，UFPs組分別為69%、65%、73%、72%(圖1)。

n=10、 A, LVDP； B, +dp/dtmax； C,-dp/dtmax； D, CF. *P<0.05 vs. UFPs-treated group at 0 min, # P<0.05 vs. control group at the same time point.圖1 UFPs(12.5 mg/L)灌注對大鼠離體心臟的影響Figure 1 Effect of UFPs (12.5 mg/L) perfusion on isolated rat heart

2.2 UFPs灌注激活氧化應(yīng)激系統(tǒng)

測定收集的肺動脈流出液氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)正常對照組MDA明顯低于UFPs組(P<0.001)， UFPs組SOD、TAOC低于對照組(P<0.001，表1)， 提示UFPs組處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，抗氧化系統(tǒng)受損，抗氧化能力明顯下降。

表1 兩組肺動脈流出液MDA、TAC、SOD的比較Table 1 The comparison of MDA, TAC and SOD in the outflow of pulmonary artery between the two groups

2.3 UFPs灌注損傷大鼠心臟組織

灌流結(jié)束，肉眼可見對照組大鼠心臟顏色紅潤，UFPs處理組大鼠心臟局部可見組織顏色發(fā)白；光鏡下對照組大鼠心臟可見心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，UFPs處理組見局部心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)水腫(圖2)。

A and B, control group perfusion map and perfusion trend graph; E and F, UFPs group perfusion map and perfusion trend graph. C and G, control group and UFPs group perfusion end heart. D and H, the pathological changes of myocardium in control group and UFPs group (HE staining ×400).圖2 UFPs干預(yù)引起心臟功能惡化Figure 2 UFPs intervention caused deterioration of cardiac function

2.4 UFPs上調(diào)MAPK家族蛋白的表達(dá)

大鼠離體心臟組織石蠟標(biāo)本行免疫組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，UFPs組p-p38 MAPK、p-ERKs和p-JNKs均呈高表達(dá)：p-p38 MAPK定位在細(xì)胞核，可見棕色的陽性核增加，p-ERKs和p-JNKs定位在細(xì)胞質(zhì)，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕色表達(dá)增強(qiáng)(圖3)。Western blots結(jié)果也提示UFPs灌注大鼠心臟后，p-p38 MAPK、p-ERKs、p-JNKs表達(dá)上調(diào)，兩組比較各指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示UFPs激活了MAPK信號通路(圖4)。

Immunohistochemical images showed the expression of p-p38 MAPK, p-ERKs and p-JNKs in the myocardium of normal control group and UFPs-treated group (×400). The UFPs treatment group showed high expression of p-p38 MAPK, p-ERKs and p-JNKs (indicated by arrows).圖3 大鼠心肌病理學(xué)變化(IHC ×400)Figure 3 Pathological changes of rat myocardium (IHC ×400)

The levels of phosphorylated p38 MAPK, ERKs and JNKs were determined by Western blots assay. Values are given as n=6 for each group. *P<0.05， UFPs-treated group vs. normal control group.圖4 UFPs灌流30 min誘導(dǎo)MAPK家族成員的磷酸化Figure 4 UFPs perfused for 30 minutes, induced the phosphorylation of MAPK family members

3 討論

本研究采用美國NIST的顆粒物標(biāo)準(zhǔn)品[11-12]，研究UFPs對大鼠離體心臟血流動力學(xué)指標(biāo)及CF的影響，發(fā)現(xiàn)UFPs灌注引起大鼠心臟功能直接、急性惡化，且該損傷作用不依賴于肺部的間接效應(yīng)。UFPs對血管有直接的抑制效應(yīng)，引起CF的下降。

氧化應(yīng)激是顆粒物損傷機(jī)體的重要機(jī)制之一[10]。Kim等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)燃機(jī)排放微粒(12.5～50.0 mg/L)灌注增加了離體心臟心律失常的發(fā)生率，其機(jī)制為氧化應(yīng)激和鈣調(diào)蛋白激酶的激活。研究報(bào)道[14]，機(jī)體氧化應(yīng)激的程度隨著周圍環(huán)境微粒水平的上升而增加。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)顆粒物濃度的升高，濃度依賴引起心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平增高，導(dǎo)致了細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)包括SOD及TAOC等，對于保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)UFPs組灌流液中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA較正常組升高，而SOD及TAOC均下降，提示氧化應(yīng)激參與了UFPs誘導(dǎo)的心臟損傷。

MAPK家族作為活性氧的下游信號之一，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、生存和凋亡的功能。MAPK家族參與多種心臟疾病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，JNKs和p38 MAPK被認(rèn)為是心肌細(xì)胞應(yīng)激信號通路中促進(jìn)凋亡的主要調(diào)節(jié)因子，ERKs則在心肌細(xì)胞受到應(yīng)激時(shí)被激活發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)[16-17]。近來的研究顯示，細(xì)胞暴露于顆粒物時(shí)，MAPK信號通路被激活，調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)及黏附分子的表達(dá)[18-19]。本課題組前期研究結(jié)果表明，細(xì)顆粒物干預(yù)大鼠心肌細(xì)胞引起p38 MAPK、ERKs、JNKs的迅速激活[15]。本研究在離體心臟水平再次證實(shí)，UFPs暴露后MAPK家族成員迅速激活，提示MAPK信號通路可能在UFPs誘導(dǎo)的心臟損傷中起重要作用，顆粒物導(dǎo)致的心臟損傷至少部分是通過MAPK信號通路介導(dǎo)的。

綜上所述，UFPs有直接、急性的心臟毒性，降低大鼠離體心臟心肌收縮力和冠脈血流量，導(dǎo)致氧化/抗氧化失衡，激活MAPK信號通路。由于離體實(shí)驗(yàn)未能模擬顆粒物的吸入后效應(yīng)，因此顆粒物體內(nèi)效應(yīng)的確切機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。