王緒平 張 揚# 黃孝聞 王娜妮 張 麗 張子玥 壽 旦

1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

3 上海財經(jīng)大學(xué)浙江學(xué)院 浙江 金華 321013

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(DOP)是糖尿病并發(fā)骨量減少，易骨折的疾病，近年發(fā)病率呈上升趨勢。目前DOP的治療存在療效不確切、藥物不良反應(yīng)等問題[1]。因此尋找安全有效的DOP治療藥物具有重要價值和現(xiàn)實意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為DOP屬于“消渴”“骨痿”范疇，補(bǔ)腎固本是其治療大法[2]。補(bǔ)腎健骨類中藥淫羊藿、骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、菟絲子、女貞子等是治療該癥的中藥，文獻(xiàn)資料表明該類中藥具有促進(jìn)骨愈合的作用[3，4]。有關(guān)DOP的研究表明，高濃度葡萄糖對成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化產(chǎn)生明顯的抑制作用[5，6]。胰島素受體底物（IRS1）作為調(diào)節(jié)β細(xì)胞功能的重要信號分子，通過PI3K通路調(diào)節(jié)胰島素分泌[7]。PI3K/AKT通路也與骨代謝關(guān)系密切。胰島素依賴型糖尿病通過抑制AKT，減弱骨形成[8]。

本研究擬拓展對補(bǔ)腎健骨類中藥在骨類疾病中的作用研究，通過建立高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞模型，檢測IRS1表達(dá)，闡明淫羊藿苷等補(bǔ)腎健骨類中藥活性成分保護(hù)高糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制，為中藥在DOP的研發(fā)方面提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 實驗動物：新生大鼠由浙江省中醫(yī)藥研究院動物房提供，購于浙江省動物實驗中心，動物實驗許可證號：SYXK（浙）20190010。

1.2 儀器：311型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，USA）；ECLIPSE Ti型倒置熒光顯微鏡（Nikon，Japan）；microfuge 20R小型高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN COULTER）；Spectra Max 190全波長酶標(biāo)儀（Molecular Devices，USA）；NEST細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)皿（無錫耐思生物科技有限公司）；AE240電子天平（Switzerland）；超低溫冰箱（Thermo，USA）；超低溫冰箱（Thermo，USA）；美國ABI RT-PCR儀。

1.3 藥品及試劑：柚皮苷（中國藥品生物制品檢定所，批號：110722-201910）；補(bǔ)骨脂二氫黃酮（寶雞市辰光生物科技有限公司，批號：20191103）；淫羊藿苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110703-201809）；DMEM培養(yǎng)基（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號：1712201806）；胎牛血清（Gibco，批號：1907133）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：20180828）；DMSO（VETEC，批號：WXBC1590V）；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原蛋白酶均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。β-actin、IRS1、AKT、Runx2引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司；BioRT cDNA First Strand Synthesis Kit（杭州博日科技有限公司，批號：20190601）；BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit（杭州博日科技有限公司，批號：20190902）；AKT抗體（批號：ab66138）、Runx2抗體（批號：ab76956）、GAPDH抗體（批號：ab181602）、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(批號：ab6721)及山羊抗鼠IgG(批號：ab8245)（英國Abcam公司）。

2 方法

2.1 原代大鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)：將新生24h內(nèi)的Wistar大鼠，引頸處死，75%酒精消毒。無菌操作取顱蓋骨。將顱蓋骨置于含DMEM液的培養(yǎng)皿中，盡量去除顱蓋骨上的骨膜、血管及結(jié)締組織，DMEM液反復(fù)洗滌至骨片發(fā)白。將骨片置于0.25%胰蛋白酶-EDTA液中，用剪刀剪成1mm×1mm×1mm的組織塊。先后用0.25%胰蛋白酶-EDTA液與0.1%Ⅱ型膠原酶37℃水浴消化。離心棄上清，DMEM液重懸，離心棄上清。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，吹打均勻，接種至培養(yǎng)瓶中。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每3d換液1次。待細(xì)胞長滿后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA 液消化傳代接種適宜的實驗器皿中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 實驗分組與給藥：取第3代生長良好的大鼠成骨細(xì)胞，以1×105接種于96孔板，實驗分4組：空白組、葡萄糖高劑量組（45mmol/L）、葡萄糖中劑量組（30mmol/L）和葡萄糖低劑量組（20mmol/L）。培養(yǎng)24h充分貼壁后，各組更換不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，48h，72h后測定。

精確稱取相應(yīng)對照品柚皮苷、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、淫羊藿苷，用PBS液配成0.3mg/ml，臨用前用DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，0.22μm濾器除菌，4℃保存?zhèn)溆?。取上述實驗中葡萄糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞最佳濃度為高糖成骨細(xì)胞模型。分別加入前期預(yù)實驗結(jié)果中最佳濃度的柚皮苷、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、淫羊藿苷對照品。

2.3 MTT法測定成骨細(xì)胞活性：取生長良好的大鼠成骨細(xì)胞，以1×105接種于96孔板中，實驗分為5組：空白組、葡萄糖組、柚皮苷組、補(bǔ)骨脂二氫黃酮組和淫羊藿苷組，各組分別加入相應(yīng)培養(yǎng)液作用24h、48h、72h后，采用MTT法測定各組不同培養(yǎng)時間的成骨細(xì)胞活力，按照公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(A實驗組/A對照組)×100%。

2.4 RT-PCR檢測成骨細(xì)胞PI3K、IRS1、Runx2的mRNA表達(dá)水平：大鼠成骨細(xì)胞接種于6孔板中，實驗分為5組：空白組、模型組（加入30mmol/L的葡萄糖）、柚皮苷組、補(bǔ)骨脂二氫黃酮組及淫羊藿苷組。柚皮苷組、補(bǔ)骨脂二氫黃酮組、淫羊藿苷組分別選取前期實驗中最佳給藥濃度進(jìn)行給藥，各組分別加入相應(yīng)培養(yǎng)液作用24h，用Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實時熒光定量PCR檢測。以β-actin為內(nèi)參基因，采用ΔΔCt法進(jìn)行分析，PCR引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2.5 Western Blot檢測成骨細(xì)胞AKT、IRS1、Runx2蛋白表達(dá)的影響：大鼠成骨細(xì)胞按“2.1”和“2.4”培養(yǎng)細(xì)胞，并給藥，給藥后48h收集各組細(xì)胞，裂解并提取總蛋白。用BCA法測定樣本蛋白濃度，各組取20μg蛋白進(jìn)行電泳，室溫下，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液封閉。封閉后與1∶1000稀釋的一抗（AKT、IRS1、Runx2、GAPDH抗體）4℃孵育過夜。次日加相應(yīng)二抗室溫下孵育1h，PBST洗滌PVDF膜3次，每次5min，BioRad系統(tǒng)曝光。收集條帶用“Image Lab”軟件量化。

2.6 統(tǒng)計學(xué)處理：實驗數(shù)據(jù)和資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用配對t檢驗(a=0.05)，比較各組間實驗結(jié)果，并進(jìn)行差異分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 高糖誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下可見，正常成骨細(xì)胞接種后懸浮在培養(yǎng)液中，形態(tài)為圓形透亮的小顆粒，4h后即可見部分細(xì)胞貼壁，并開始逐步伸展。24h后活細(xì)胞逐漸伸出偽足樣的突起，形態(tài)多不規(guī)則，胞漿豐富，胞核較圓，輪廓清晰。48h后可見主要為梭形，5d左右貼滿瓶壁，不規(guī)則排列。約14d左右開始形成礦化結(jié)節(jié)，可逐漸增大，呈簇狀。高糖環(huán)境下成骨細(xì)胞形態(tài)與空白對照組的細(xì)胞比較，模型組的細(xì)胞經(jīng)高糖作用7天后細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞體收縮，突起變短，細(xì)胞核縮小，不規(guī)則。見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)時間和高糖誘導(dǎo)的原代大鼠成骨細(xì)胞形態(tài)圖

3.2 高糖作用對成骨細(xì)胞增殖的影響：高糖對成骨細(xì)胞存活率的影響見表2。由表2可知，葡萄糖高、中、低劑量組分別作用于成骨細(xì)胞24h后，與空白對照組比較，細(xì)胞活性均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。作用成骨細(xì)胞48h后，模型組的細(xì)胞活性下降，其中葡萄糖中劑量組下降最大。

表2 高糖對成骨細(xì)胞存活率的影響(±s)

表2 高糖對成骨細(xì)胞存活率的影響(±s)

注：與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

劑量（mmol/L）組別空白對照組葡萄糖低劑量組葡萄糖中劑量組葡萄糖高劑量組72h 0.310±0.038 0.216±0.081#0.163±0.020##0.179±0.027##5.5 20.0 30.0 45.0 24h 0.165±0.018 0.286±0.081##0.233±0.061#0.215±0.042#吸光度（OD值）48h 0.267±0.028 0.248±0.017 0.209±0.020#0.240±0.032#

在高糖作用成骨細(xì)胞72h后，模型組的細(xì)胞活性繼續(xù)下降，各劑量組與正常成骨細(xì)胞活性的空白對照組比較，有顯著性差異（P＜0.05)，其中葡萄糖中劑量組下降最大。結(jié)果表明，成骨細(xì)胞在高糖環(huán)境下其細(xì)胞活力隨葡萄糖作用時間及濃度的變化而變化，其中葡萄糖中劑量組對細(xì)胞損傷最大，故后續(xù)試驗選用葡萄糖30mmol/L給藥，即為模型組。

3.3 補(bǔ)腎健骨中藥活性成分促進(jìn)高糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的增殖作用：由表3可知，高糖作用48h、72h后與空白對照組相比吸光度（OD值）均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），顯示模型組細(xì)胞生長活力下降。淫羊藿苷給藥48h后，與模型組比較OD值均顯著增加，顯示給藥組細(xì)胞生長活力上升（P＜0.05，P＜0.01），柚皮苷、補(bǔ)骨脂二氫黃酮組細(xì)胞增殖不明顯。提示淫羊藿苷能改善葡萄糖對成骨細(xì)胞生長的抑制作用。

表3 3種成分對高糖成骨細(xì)胞存活率的影響(±s)

表3 3種成分對高糖成骨細(xì)胞存活率的影響(±s)

注：空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別空白對照組模型組柚皮苷組補(bǔ)骨脂二氫黃酮組淫羊藿苷組吸光度（OD值）72小時0.345±0.023 0.163±0.020##0.157±0.004 0.168±0.029 0.185±0.021劑量（mg/ml）—5.4000 0.0580 0.0324 0.0677吸光度（OD值）24小時0.169±0.019 0.216±0.032#0.185±0.026 0.206±0.072 0.203±0.038吸光度（OD值）48小時0.260±0.045 0.1819±0.033##0.193±0.010 0.203±0.011 0.221±0.014*

3.4 中藥活性成分對高糖成骨細(xì)胞IRS1、AKT、Runx2的mRNA表達(dá)的影響：與空白對照組比較，模型組AKT、IRS1的mRNA的表達(dá)水平下降（P＜0.05，P＜0.01），與模型組比較，中藥活性成分柚皮苷、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、淫羊藿苷均可上調(diào)AKT、IRS1、Runx2的mRNA表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)果如表4所示。

表4 3種成分對AKT、IRS1、Runx2的mRNA表達(dá)量的影響(±s)

表4 3種成分對AKT、IRS1、Runx2的mRNA表達(dá)量的影響(±s)

注：與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別空白對照組模型組柚皮苷組補(bǔ)骨脂二氫黃酮組淫羊藿苷組Runx2 1.00±0.00 0.79±0.02#1.22±0.09*1.65±0.11*1.89±0.88*劑量（mg/ml）—5.4000 0.0580 0.0324 0.0677 AKT 1.00±0.00 0.84±0.07#2.27±0.30*1.56±0.21*1.65±0.13*IRS1 1.00±0.00 0.672±0.05##3.706±0.13**1.292±0.03**5.099±0.68*

3.5 中藥活性成分對高糖成骨細(xì)胞AKT、IRS1、Runx2蛋白表達(dá)的影響：結(jié)果見圖2，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞AKT、IRS1、Runx2的蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)。與模型組比較，中藥活性成分柚皮苷組、補(bǔ)骨脂二氫黃酮、淫羊藿苷組均能提高AKT、IRS1、Runx2的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）。

圖2 各組AKT、IRS1、Runx2蛋白水平表達(dá)情況

4 討論

項目組前期藥物篩選的研究提示，補(bǔ)腎健骨中藥骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、淫羊藿中的有效成分柚皮苷、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和淫羊藿苷，具有促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖作用。文獻(xiàn)顯示，上述3種成分均具有促進(jìn)骨愈合的作用，能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[8-11]。本研究結(jié)果表明，成骨細(xì)胞在高糖介入的環(huán)境中，其細(xì)胞活力隨葡萄糖作用時間及濃度的變化而變化，作用24h細(xì)胞活力增加，48h、72h細(xì)胞活力下降，細(xì)胞增殖呈先揚后抑趨勢。在高糖誘導(dǎo)的模型細(xì)胞中加入3種活性成分，結(jié)果提示淫羊藿苷能顯著增強(qiáng)高糖成骨細(xì)胞活力。

有研究表明，骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)信號通路中，BMPSmads、PI3K/AKT等信號通路主要作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨形成[12，13]。BMP-Smads信號通路是成骨細(xì)胞增殖相關(guān)的關(guān)鍵及經(jīng)典通路，進(jìn)入核內(nèi)，激活Smad1/5/8，啟動磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Runx2，上調(diào)特異性成骨細(xì)胞產(chǎn)物，促進(jìn)骨基質(zhì)合成及礦化反應(yīng)[14，15]。

本研究證實，我們選取的3種補(bǔ)腎中藥活性成分可調(diào)控高糖誘導(dǎo)下成骨細(xì)胞中的ISR1/AKT/Runx2信號通路，從而影響高糖介入環(huán)境下的大鼠成骨細(xì)胞。本實驗探究補(bǔ)腎健骨中藥有效成分保護(hù)高糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的作用機(jī)制，為臨床防治DOP新藥的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。