黃陸平 余綺旻 陳思佳 王均爐#

1 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 浙江 溫州 325000

2 浙江省臺(tái)州醫(yī)院 浙江 臺(tái)州 318000

膿毒癥是由于宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，隨著病原體刺激和促炎細(xì)胞因子釋放，產(chǎn)生損傷微循環(huán)功能的全身炎癥反應(yīng)[1]。干擾素基因刺激蛋白（STING）是一種主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白，常由一些異常的DNA片段觸發(fā)而激活，從而調(diào)控1型干擾素和促炎細(xì)胞因子的生成[2]。STING激活可以啟動(dòng)靶向活性自然殺傷細(xì)胞（TANK）結(jié)合激酶1（TBK1）的磷酸化和激動(dòng)核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路[3]。在本研究中建立膿毒癥模型，采用電針干預(yù)，探討其對(duì)肺損傷的影響和可能的相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 小鼠膿毒癥模型和實(shí)驗(yàn)分組：選取6～8周C57BL/6小鼠，購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華公司。小鼠腹腔注射脂多糖（LPS，10mg/kg）構(gòu)建膿毒癥模型，假手術(shù)組小鼠注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)總共分為3組：假手術(shù)組、LPS組、LPS+電針組。

1.2 電針處理：小鼠腹腔注射LPS后1小時(shí)，開(kāi)始電針處理。選取足三里和肺俞穴位，用韓式電針刺激儀連接針灸針刺激30min，頻率2/15Hz，電流1mA。

1.3 HE染色：肺組織切片行HE染色。肺損傷評(píng)分指標(biāo)為肺泡壁厚度、肺泡腔充血、血管出血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況：輕微損傷為損傷程度＜25%；中度損傷為損傷程度25%～50%；重度損傷為損傷程度50%～75%；極重度損傷為損傷程度＞75%。

1.4 肺干濕比檢測(cè)：取小鼠右上肺葉，稱(chēng)量肺葉重量。接著把肺葉放在60℃烘箱中，72小時(shí)后取出稱(chēng)重，把剛?cè)〕龅姆稳~重量與從烘箱中取出的重量相比即為干濕比，用濕重/干重表示。

1.5 Western blot：取小鼠新鮮肺組織，加入RIPA、PMSF和蛋白磷酸酶抑制劑的混合液，用勻漿器勻漿，4℃ 10000rpm離心30min。取上清，用BCA試劑盒測(cè)各樣本蛋白濃度。每個(gè)樣本加入相同質(zhì)量的蛋白電泳，后電轉(zhuǎn)1.5小時(shí)轉(zhuǎn)入PVDF膜，加入5%牛奶常溫封閉2h，于一抗 STING（1∶1000，CST）、TBK1（1∶1000，CST）、磷酸化TBK1（P-TBK1，1∶1000，affinity）、NF- κB（1∶1000，CST）、磷酸化 NF-κB（P-NF-κB，1∶1000，affinity）中孵育過(guò)夜。第2天于二抗中孵育1小時(shí)。用ECL試劑盒曝光，蛋白表達(dá)量用Image Lab 6.0軟件分析。

1.6 炎癥因子檢測(cè)：取小鼠血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)其α腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的表達(dá)水平。吸光度用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)使用SPSS 17.0軟件分析。計(jì)量資料用-x±s表示。多組數(shù)據(jù)組間的差異性比較采用單因素方差分析Bonferroni檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色、干濕比和炎癥因子觀(guān)察急性肺損傷程度：正常小鼠肺組織HE染色顯示肺泡壁薄且完整，LPS小鼠的肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁厚且肺泡腔有出血。電針處理可以明顯減輕肺損傷（P＜0.01），表現(xiàn)為肺泡壁輕度增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，見(jiàn)圖1。檢測(cè)肺組織干濕比評(píng)估肺水腫程度，發(fā)現(xiàn)相比假手術(shù)組，LPS組的肺組織干濕比明顯增加（P＜0.01）。電針處理減少LPS引起的肺水腫，表現(xiàn)為干濕比下降（P＜0.01），見(jiàn)表1。除此，結(jié)果顯示相比假手術(shù)組，LPS組小鼠血清TNF-α和IL-6的水平明顯增加（P＜0.01），電針處理可以減輕膿毒癥小鼠血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 小鼠肺組織HE染色

2.2 小鼠肺組織STING、P-TBK1/TBK1、P-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)比較：與假手術(shù)組相比，LPS組小鼠肺組織STING含量明顯增高，下游相關(guān)蛋白P-TBK1/TBK1、PNF-κB/NF-κB的表達(dá)水平上升（P＜0.01），而相比LPS組，LPS+電針組小鼠肺組織STING、P-TBK1/TBK1、P-NF-κB/NF-κB的蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），見(jiàn)圖2和表1。

圖2 STING、P-TBK1、TBK1、P-NF-κB、NF-κB蛋白Western blot圖

表1 肺損傷相關(guān)指標(biāo)和肺組織STING、P-TBK1/TBK1、P-NF-κB/NF-κB蛋白比較（±s）

表1 肺損傷相關(guān)指標(biāo)和肺組織STING、P-TBK1/TBK1、P-NF-κB/NF-κB蛋白比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別假手術(shù)組LPS組LPS+電針組肺組織損傷評(píng)分0.67±0.82 7.33±1.21**5.17±1.17#相對(duì)干濕比1.00±0.05 1.22±0.07**1.08±0.05##TNF-α（pg/ml）65.72±6.90 149.08±13.39**123.85±16.79#IL-6（pg/ml）36.60±4.60 90.20±9.57**75.14±10.39#STING 1.00±0.39 2.70±0.54**1.94±0.50#P-TBK1/TBK1 1.00±0.09 1.98±0.28**1.55±0.26#P-NF-κB/NF-κB 1.00±0.11 1.89±0.19**1.56±0.21#

3 討論

膿毒癥引起的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征具有高發(fā)病率和高致死率。肺為嬌臟，不耐寒熱，而針刺可調(diào)血?dú)狻⑼ń?jīng)脈，減少肺氣郁滯，使肺腑功能趨于平衡。肺俞為肺臟經(jīng)氣輸注之處，有宣肺平喘之功效，能補(bǔ)益肺氣、通利氣機(jī)，而足三里具有補(bǔ)中益氣、通經(jīng)活絡(luò)之功能，“肺俞-足三里”共同配伍使用頻率高。有研究報(bào)道電針大鼠足三里穴位和肺俞穴位可以減輕體外循環(huán)引起的急性肺損傷[4]；而電針可以改善膿毒癥大鼠的腸道機(jī)械屏障功能[5]。因此，本研究選取了足三里和肺俞，發(fā)現(xiàn)電針后處理可以減輕LPS小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化，減少肺組織水腫。膿毒癥引起肺組織凋亡和細(xì)胞壞死，而STING可以通過(guò)感應(yīng)凋亡或壞死的DNA來(lái)觸發(fā)促炎細(xì)胞因子和干擾素的分泌進(jìn)而加重組織的炎癥反應(yīng)。在膿毒癥模型中，我們發(fā)現(xiàn)STING在肺組織的表達(dá)量大量增加，而電針足三里和肺俞可以減少膿毒癥小鼠肺組織STING的表達(dá)和炎癥反應(yīng)。研究表明電針可以抑制脂多糖引起的膿毒癥大鼠肺組織NF-κB的激活，減輕炎癥因子釋放[6]。而我們的實(shí)驗(yàn)中也證明了電針可以抑制TBK1磷酸化和NF-κB通路激活。

綜上所述，電針可能通過(guò)調(diào)控STING及其下游相關(guān)蛋白TBK1和NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)，減輕膿毒癥的小鼠急性肺損傷，本研究為進(jìn)一步完善電針治療膿毒癥肺損傷提供了理論基礎(chǔ)。