吳明東,葉潔桐,朱蓓蕾,葉芳敏,麗水市人民醫(yī)院藥學(xué)部 浙江省麗水市323000

汪望月,浙江省人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省杭州市 310000

0 引言

胃癌是臨床上較為常見的一類消化系統(tǒng)腫瘤.近年來,我國胃癌的發(fā)病率不僅一直居高不下,且有攀升的趨勢[1].目前其治療方式依然是以手術(shù)和化療相結(jié)合的綜合治療為主；其中化療是重要的治療手段,特別是針對手術(shù)無法根治以及胃癌晚期的患者[2,3].但在化療進程中,胃癌細(xì)胞會通過多種方式對各類化療藥物產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致胃癌的化療效果降低[4].因此,深入研究胃癌細(xì)胞耐藥的分子機制,并尋找逆轉(zhuǎn)耐藥性的有效靶點成為醫(yī)學(xué)工作者的重要課題,其也對提高化療療效具有重要意義.

腫瘤細(xì)胞的耐藥性大多為獲得性耐藥,產(chǎn)生機制復(fù)雜,且往往表現(xiàn)為多因素事件,可涉及多種機制的聯(lián)合作用,不同機制間可相互影響[5].目前研究已發(fā)現(xiàn)的耐藥機制主要包括[6-9]：細(xì)胞膜上某些蛋白的異常表達(dá)導(dǎo)致藥物攝入減少和/或外排增多,從而引起細(xì)胞內(nèi)有效的藥物濃度降低；如拓補異構(gòu)酶Ⅱ等的異常表達(dá),導(dǎo)致化療藥物的作用靶點在質(zhì)與量上出現(xiàn)改變,降低了藥物的細(xì)胞毒性；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等的異常表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞的解讀防御功能和DNA修復(fù)功能增強；抗凋亡和促凋亡基因的異常表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)凋亡抑制等.

大量研究顯示長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)雖然不具備編碼蛋白質(zhì)的功能,但在包括基因表達(dá)以及染色體修飾等在內(nèi)的多種生物過程中發(fā)揮著重要的作用,其可影響腫瘤的疾病進展[10].長基因間非編碼RNA 152(long intergenic noncoding RNA 152,Linc00152)定位于人2號染色體2p11.2,已被證實在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)[11-13].Zhao等[14]的研究通過lncRNA芯片分析發(fā)現(xiàn)Linc00152在胃癌中高表達(dá),而下調(diào)Linc00152可抑制HGC-27和SGC-7901的增殖和周期G1/S轉(zhuǎn)換、抑制細(xì)胞侵襲和遷移、促進細(xì)胞凋亡.但Linc00152對胃癌細(xì)胞耐藥的作用尚不清晰.本研究通過小分子干擾技術(shù)下調(diào)胃癌絲裂霉素(mitomycin,MMC)耐藥細(xì)胞中的Linc00152,系統(tǒng)的探究了Linc00152在胃癌細(xì)胞NCI-N87中對MMC耐藥的影響及其相關(guān)作用機制.

1 材料和方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞系NCI-N87購自美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)細(xì)胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司；一加轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化培養(yǎng)基(I reduced serum medium modification of minimum Eagle's medium,Opti-MEM I)及洛斯維公園紀(jì)念研究所-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640,RPMI-1640)培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Linc00152小分子干擾RNA(small interference RNA targeting for Linc00152,si-Linc00152)及陰性對照siRNA (siRNA for negative control,si-NC)由上海生工生物技術(shù)有限公司提供；Trizol提取試劑盒、脂質(zhì)體-3000(Lipofectamine 3000)及相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；SYBR熒光染料與Ex-Taq酶預(yù)混液(SYBR Premix Ex Taq TM)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]試劑盒及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(AnnexinV-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic acid proteinase 3,caspase3)、劈裂的caspase3(cleavedcaspase3)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗購自美國Abcam公司；P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、層粘連蛋白受體1前體抗原(P37-kDa laminin receptor-1 precursor antigen,Mgr1-Ag)和多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistanceassociated protein,MRP)一抗購自北京博奧森生物科技有限公司；MMC購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；順鉑購自齊魯制藥公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及耐藥細(xì)胞構(gòu)建：NCI-N87細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件設(shè)置為37 ℃、含5% CO2及飽和濕度.NCI-N87/MMC耐藥細(xì)胞是通過向培養(yǎng)液中連續(xù)加入MMC來構(gòu)建,培養(yǎng)過程中間斷性(每2-3 wk遞增0.5 μg/mL)逐步提高培養(yǎng)液中MMC的濃度,直至細(xì)胞在含8 μg/mL的MMC培養(yǎng)液中保持良好生長.MTT法檢測細(xì)胞對MMC和順鉑的耐藥性后,用于后續(xù)實驗.

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染組別設(shè)置為對照組(Ctrl),陰性對照組(si-NC)和Linc00152干擾組(si-Linc00152).轉(zhuǎn)染方法：取對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞生長至約70%融合時進行轉(zhuǎn)染.將si-Linc00152或si-NC加入Opti-MEM I優(yōu)化培養(yǎng)基中,室溫靜置5 min,標(biāo)記為1號液；將Lipofectamine 3000加入Opti-MEM I優(yōu)化培養(yǎng)基中,室溫靜置5 min,標(biāo)記為2號液；輕柔混合1號液和2號液,置于室溫繼續(xù)反應(yīng)25 min.分別將混合液對應(yīng)加入已分好組的細(xì)胞中,將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱中孵育6 h,更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)48 h.實驗重復(fù)6次.檢測轉(zhuǎn)染效率并進行后續(xù)實驗分析.

1.2.3 實時定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,Realtime PCR)：參照Trizol提取試劑盒的操作說明抽提細(xì)胞總RNA并經(jīng)紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度.取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補脫氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA).然后根據(jù)SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒說明書,將引物以及cDNA和試劑盒中相關(guān)試劑組成反應(yīng)體系(反應(yīng)體系為20 μL),在ABI 7400實時定量PCR系統(tǒng)中進行反應(yīng).反應(yīng)程序設(shè)置：94 ℃ 4 min,然后進行40個PCR循環(huán)(94℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s).采用2-△△CT法分析基因相對表達(dá)量,其中Linc00152采用18S rRNA為內(nèi)參,MDR1、Mgr1-Ag和MRP mRNA采用GAPDH為內(nèi)參.實驗重復(fù)6次.引物序列見表1.

表1 引物序列

表2 胃癌細(xì)胞NCI-N87對化療藥物的敏感性(IC50)(μg/mL)

表3 下調(diào)Linc00152可提高耐藥細(xì)胞NCI-N87/MMC對化療藥物的敏感性(IC50)(μg/mL)

1.2.4 化療藥物敏感性檢測：取對數(shù)生長期的細(xì)胞按照1×105mL的密度接種至96孔板中,每孔設(shè)置三個平行孔.待細(xì)胞貼壁生長至約80%,換無血清培養(yǎng)基同步化12 h,加入不同濃度的MMC(濃度梯度設(shè)置為0、2、4、8、16、32 μg/mL)或順鉑(cisplatin,濃度梯度設(shè)置為0、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,加入20 μL的MTT試劑后繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,棄去孔內(nèi)液體后加入100 μL的DMSO,振搖后采用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的吸光度值,計算各藥物的半數(shù)抑制濃度IC50,評估細(xì)胞的耐藥性.實驗重復(fù)6次.并比較已轉(zhuǎn)染si-Linc00152的NCI-N87/MMC細(xì)胞對MMC敏感性的變化.

1.2.5 AnnexinV-FITC/PI染色：采用Annexin V/PI 雙染色法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況.收集各組細(xì)胞后,用冰PBS漂洗2次,加入500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞.避光加入Annexin V-FITC混勻后,室溫孵育15 min,上機前5 min加入PI染液避光染色.之后,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測激發(fā)波長488 nm發(fā)射波長530 nm處的細(xì)胞分布情況,并據(jù)此評估細(xì)胞的凋亡率.實驗重復(fù)6次.

1.2.6 Western blot：加RIPA裂解細(xì)胞,并離心收集蛋白,之后采用BCA法進行蛋白定量并計算上樣量(上樣蛋白總量為60 μg).各組上樣樣品中加入4倍體積的上樣緩沖液,煮沸變性.用微量加樣器上樣后行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,待藍(lán)色的溴酚藍(lán)泳出凝膠時即可轉(zhuǎn)膜.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取出聚二偏氟乙烯膜,加5%的脫脂乳粉封閉90 min.依據(jù)說明書要求先后加入相應(yīng)比例的一抗和二抗孵育液,其中一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h.免疫反應(yīng)結(jié)束后,用TBST振搖洗滌PVDF膜,10 min′3次.轉(zhuǎn)移至暗室中灑ECL化學(xué)發(fā)光液、曝光并顯影.將實驗結(jié)果掃描至電腦中,采用Image J軟件對蛋白表達(dá)條帶進行分析.實驗重復(fù)6次.

統(tǒng)計學(xué)處理將本組研究涉及數(shù)據(jù)錄入Graphpad prism 8軟件中進行統(tǒng)計學(xué)分析,實驗結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD),兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗；多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析,兩兩比較則采用Bonferroni校正檢驗,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性.

2 結(jié)果

2.1 Linc00152的表達(dá)與胃癌細(xì)胞NCI-N87化療耐藥之間的關(guān)系 本實驗首先檢測了人胃癌細(xì)胞系NCI-N87及其MMC耐藥細(xì)胞系NCI-N87/MMC對化療藥物的敏感性(表2),結(jié)果證明NCI-N87/MMC的對MMC的耐藥性顯著強于NCI-N87細(xì)胞,并對順鉑產(chǎn)生了交叉耐藥.同時Real-Time PCR的檢測結(jié)果顯示(圖1A),NCI-N87/MMC中Linc00152的表達(dá)水平顯著高于其親本細(xì)胞NCI-N87,提示Linc00152的表達(dá)可能與胃癌細(xì)胞NCI-N87的MMC耐藥之間存在一定的關(guān)系.

2.2 下調(diào)Linc00152對NCI-N87/MMC化療敏感性的影響 為進一步證明Linc00152的表達(dá)與NCI-N87化療耐藥之間的關(guān)系,本實驗采用小分子RNA干擾技術(shù)下調(diào)NCI-N87/MMC細(xì)胞中Linc00152的表達(dá),并檢測其化療藥物敏感性的變化.轉(zhuǎn)染效率檢測如圖1B所示,相較于對照組,si-Linc00152組細(xì)胞中Linc00152的表達(dá)顯著降低.MTT檢測結(jié)果顯示,下調(diào)NCI-N87/MMC細(xì)胞中Linc00152的表達(dá)后,細(xì)胞對MMC及順鉑的敏感性明顯增加(P＜0.05,見表3).

2.3 下調(diào)Linc00152對NCI-N87/MMC細(xì)胞凋亡的影響 本實驗采用流式細(xì)胞術(shù)評估了下調(diào)Linc00152對NCI-N87/MMC細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示(圖2),相較于對照組細(xì)胞,si-Linc00152組細(xì)胞的早期凋亡率由(14.59±1.37)%增加至(38.67±3.54)%(P＜0.05)；而中晚期細(xì)胞凋亡/壞死率由(7.65±1.53)%增加至(11.97±1.69)%.表明下調(diào)Linc00152可顯著促進耐藥細(xì)胞NCI-N87/MMC的凋亡.

2.4 下調(diào)Linc00152對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響 Western Blot檢測(圖3)結(jié)果顯示,相較于對照組,si-Linc00152組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著下降,而凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase3的蛋白水平明顯增加.

圖1 Linc00152的表達(dá)情況.A:NCI-N87和NCI-N87/MMC細(xì)胞中Linc00152的表達(dá)情況.B:轉(zhuǎn)染si-Linc00152或si-NC后NCI-N87/MMC細(xì)胞中Linc00152的表達(dá)情況.NCI-N87/MMC:基于NCI-N87細(xì)胞構(gòu)建的絲裂霉素耐藥胃癌細(xì)胞；Ctrl:對照組；si-NC:陰性對照組；si-Linc00152:Linc00152干擾組.與NCI-N87細(xì)胞比較，aP＜0.05；與對照組比較，cP＜0.05.

2.5 下調(diào)Linc00152對耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響 本實驗進一步檢測了NCI-N87/MMC細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因的表達(dá)情況,結(jié)果顯示(圖4),相較于對照組,si-Linc00152組MDR1、MGr1-Ag以及MRP的mRNA表達(dá)水平顯著降低(圖4A),同時P-gp、MGr1-Ag以及MRP的蛋白表達(dá)水平也顯著降低(圖4B).提示下調(diào)Linc00152可抑制NCI-N87/MMC細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因MDR1、MGr1-Ag、MRP及其編碼的蛋白的表達(dá).

3 討論

研究發(fā)現(xiàn),Linc00152具有癌基因樣作用,其可通過不同的信號途徑調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡[15]；在胃癌中的相關(guān)研究顯示,相較于癌旁非腫瘤組織和炎性胃粘膜組織,Linc00152在胃癌組織中高表達(dá),且Linc00152的高表達(dá)能促進胃癌侵襲和遷移[14-16].本研究發(fā)現(xiàn),Linc00152在MMC耐藥的胃癌NCI-N87/MMC細(xì)胞中的表達(dá)顯著高其親本細(xì)胞NCI-N87,而通過小分子干擾技術(shù)下調(diào)NCI-N87/MMC細(xì)胞中Linc00152的表達(dá)可增加細(xì)胞對MMC以及順鉑的敏感性.由此推測,下調(diào)Linc00152可在一定程度逆轉(zhuǎn)NCI-N87/MMC細(xì)胞的化療耐藥.

考慮到Linc00152對腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用,本研究進一步從細(xì)胞凋亡的角度探討了Linc00152調(diào)控NCI-N87/MMC細(xì)胞的MMC耐藥的作用機制.流式細(xì)胞術(shù)的檢測結(jié)果顯示,下調(diào)Linc00152可顯著促進耐藥細(xì)胞NCI-N87/MMC的凋亡.該結(jié)果提示,下調(diào)Linc00152提高NCI-N87/MMC對MMC的敏感性可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān).Bcl-2家族是調(diào)控細(xì)胞凋亡最重要的基因,其中抗凋亡蛋白Bcl-2可與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體,抑制細(xì)胞凋亡[17,18].本實驗的檢測結(jié)果顯示,下調(diào)Linc00152可抑制NCI-N87/MMC細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá),同時促進Bax的蛋白表達(dá).caspase3則是細(xì)胞凋亡通路中最主要的終末剪切酶,活化后可啟動下游的級聯(lián)反應(yīng),誘發(fā)凋亡[19].本實驗中,下調(diào)Linc00152可促進NCI-N87/MMC細(xì)胞的caspase3的活化.結(jié)果表明,下調(diào)Linc00152可通過調(diào)控凋亡相關(guān)因子的表達(dá)促進NCI-N87/MMC細(xì)胞的凋亡.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)Linc00152對NCI-N87/MMC細(xì)胞凋亡的影響.Ctrl:對照組；si-NC:陰性對照組；si-Linc00152:Linc00152干擾組.與對照組比較，aP＜0.05.

圖3 下調(diào)Linc00152對NCI-N87/MMC細(xì)胞中凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響.Ctrl:對照組；si-NC:陰性對照組；si-Linc00152:Linc00152干擾組.與對照組比較，aP＜0.05.

此外,腫瘤細(xì)胞的獲得性耐藥性還與多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān).MDR1基因可通過編碼P-gp(一種ATP依賴性跨膜糖蛋白)主動泵出化療藥物,降低腫瘤細(xì)胞中有效藥物濃度[20,21].MRP主要是促進谷胱甘肽結(jié)合藥物,進而促進化療藥物外排[22].MGr1-Ag實在胃癌長春新堿耐藥細(xì)胞株SGC7901/VCR中篩選出的耐藥相關(guān)分子,不僅可以降低腫瘤細(xì)胞中藥物濃度,還可調(diào)控細(xì)胞凋亡[23,24].本實驗的檢測結(jié)果表明,下調(diào)Linc00152可抑制NCI-N87/MMC細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因MDR1、MGr1-Ag、MRP及其編碼的蛋白的表達(dá).但是其中是否還涉及其他耐藥相關(guān)的機制以及具體的分子靶點還有待進一步深入的研究.此外,因本研究僅采用NCI-N87/MMC細(xì)胞對靶向抑制Linc00152后發(fā)揮的逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用進行了初步探討,其結(jié)果具有一定局限性,因此,仍需多種化療耐藥胃癌細(xì)胞以及由化療耐藥胃癌細(xì)胞構(gòu)建的移植瘤動物模型來進一步驗證靶向抑制Linc00152在胃癌化療耐藥中的作用.

圖4 下調(diào)Linc00152對NCI-N87/MMC細(xì)胞中耐藥相關(guān)基因表達(dá)的影響.A:各組NCI-N87/MMC細(xì)胞中MDR1、MGr1-Ag和MRP的mRNA表達(dá)水平；B:各組NCI-N87/MMC細(xì)胞中MDR1、MGr1-Ag和MRP的蛋白表達(dá)水平；Ctrl:對照組；si-NC:陰性對照組；si-Linc00152:Linc00152干擾組.與對照組比較，aP＜0.05.

4 結(jié)論

綜上所述,下調(diào)Linc00152可提高MMC耐藥胃癌細(xì)胞NCI-N87/MMC對化療藥物MMC和順鉑的敏感性,其作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及下調(diào)多藥耐藥相關(guān)基因MDR1、MGr1-Ag、MRP的表達(dá)相關(guān).

文章亮點

實驗背景

胃癌化療易產(chǎn)生化療藥物耐藥,而尋找并干預(yù)影響胃癌細(xì)胞化療耐藥的特異性靶點有望逆轉(zhuǎn)耐藥性,使得胃癌化療耐藥患者獲益.

實驗動機

已有研究表明長基因間非編碼RNA 152(long intergenic noncoding RNA 152,Linc00152)在胃癌組織中高表達(dá),且其促進胃癌惡性進展.而目前尚不清楚Linc00152表達(dá)是否與胃癌化療耐藥具有內(nèi)部聯(lián)系.

實驗?zāi)繕?biāo)

探究Linc00152表達(dá)與胃癌化療耐藥之間的關(guān)系,研究敲除Linc00152是否能增強絲裂霉素(mitomycin,MMC)耐藥胃癌細(xì)胞系NCI-N87/MMC對MMC和順鉑的敏感性,并分析其中涉及的分子學(xué)機制.

實驗方法

首先,檢測NCI-N87/MMC細(xì)胞和母本細(xì)胞NCI-N87中Linc00152的表達(dá)情況.接著分析敲除Linc00152對NCI-N87/MMC細(xì)胞MMC和順鉑敏感性以及細(xì)胞凋亡的影響.最后,分析敲除Linc00152對NCI-N87/MMC細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白以及多藥耐藥相關(guān)蛋白及其基因表達(dá)的影響.

實驗結(jié)果

Linc00152在NCI-N87/MMC細(xì)胞中高表達(dá).敲除NCI-N87/MMC細(xì)胞中Linc00152表達(dá)可增加其對MMC和順鉑的敏感性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并下調(diào)多藥耐藥基因MDR1、Mgr1-Ag、MRP及其編碼的蛋白的表達(dá).

實驗結(jié)論

敲除Linc00152可部分逆轉(zhuǎn)NCI-N87/MMC對MMC和順鉑的耐藥性,其機制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并下調(diào)MDR1、MGr1-Ag、MRP的表達(dá)相關(guān).

展望前景

外源性靶向敲除Linc00152可能是增強胃癌化療耐藥患者的化療效果的潛在策略.