劉清秀,汪曉梅,呂嬌健,盧毅,趙園,麗水市人民醫(yī)院肝科感染科 浙江省麗水市 323000

樊曉鵬,麗水市人民醫(yī)院肝膽胰外科 浙江省麗水市 323000

0 引言

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類RNA轉錄的產(chǎn)物,其轉錄本長度大于200 nt,但不具備編碼蛋白質的功能.LncRNA可通過多種方式影響基因的表達,從而參與調控細胞的轉分化、代謝以及增殖凋亡等生物學行為；此外lncRNA還可調控細胞內以及細胞間復雜的信號通路,進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程[1,2].研究證實在包括胃癌、肝癌、肺癌以及乳腺癌等多類腫瘤中存在lncRNA的異常表達[3-6].肝癌是發(fā)病率和死亡率均高的常見惡性腫瘤之一,其早期的診療手段依舊十分有限,而lncRNA作為近年來備受關注的“明星分子”,有望為肝癌的診療以及靶點藥物的設計提供新的思路和方法.目前已有多項研究證實lncRNA可通過抑癌或促癌作用參與調控肝癌的發(fā)生發(fā)展.如Wu等[7]的研究結果顯示lncRNA MT1JP在肝癌組織中表達降低,且可通過下調AKT抑制肝癌的進展.Lin等[8]的研究結果則顯示lncRNA CRNDE可通過調控miR-33a-5p/CDK6軸在肝癌中發(fā)揮促癌作用.

腫瘤蛋白翻譯調節(jié)因子1-反義RNA1(tumor protein translationally controlled regulator 1-antisence RNA 1,TPT1-AS1)位于13號染色體.既往研究發(fā)現(xiàn)[9-11],TPT1-AS1在胃癌、卵巢癌以及結直腸癌等惡性腫瘤中異常高表達,并可促進上述腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲；但考慮到lncRNA作用的復雜性,lncRNA TPT1-AS1在肝癌中的具體作用和相關作用機制尚不清楚,還需大量的實驗驗證.本研究首先通過實時熒光定量PCR檢測肝癌中l(wèi)ncRNA TPT1-AS的表達情況,之后利用小分子干擾RNA下調肝癌細胞中l(wèi)ncRNA TPT1-AS的表達,初步分析其對肝癌細胞侵襲及遷移能力的影響,并通過western bot等檢測手段進一步探討其可能的作用機制,以期為肝癌的診療提供潛在的靶點和一定的實驗依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 肝癌細胞系(Huh7、SMMC-7721、HCCLM3和HepG2)及人永生化肝細胞LO2均購自中科院上海細胞庫；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、I 減血清培養(yǎng)基(I reduced serum medium modification of Eagle's minimal essential medium,Opti-MEM)培養(yǎng)基、達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(Dulbecco's modification of Eagle's medium,DMEM)培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；Trizol試劑、LipofectAMINE2000購自美國Invitrogen公司；靶向TPT1-AS1的小分子干擾RNA (siRNA targeted for TPT1-AS1,si-TPT1-AS1) 及其陰性對照小分子干擾RNA(siRNA targeted for negative control sequence,si-NC)由廣州銳博生物技術有限公司合成；PrimeScriptTMRT Master Mix kit及SYBR-Green PCR Master Mix kit購自TaKaRa公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)-鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、和三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體均購自美國Abcam公司；磷酸肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phospho-PI3K,p-PI3K)抗體購自上海泊灣生物科技有限公司；蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT)、磷酸化AKT(phospho-AKT,p-AKT)抗體購自美國Affinity Biosciences公司；其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純.

1.2 方法

1.2.1 臨床標本收集：收集2017-12/2019-12麗水市人民醫(yī)院普外科肝膽病區(qū)行肝癌切除手術患者的癌組織及其配對的癌旁正常組織.所有納入研究的12例病例均經(jīng)我院病理科確證為肝細胞癌,配對癌旁組織中無癌細胞,距離癌組織邊緣2.0 cm以上,且所選病例術前并未接受過放化療和介入等治療.本研究所有的臨床標本均經(jīng)患者簽署知情同意書并獲得麗水市人民醫(yī)院倫理委員會批準.標本離體后迅速取材并并置于凍存管中放入液氮,于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.2 細胞培養(yǎng)、分組及轉染：肝癌細胞系(Huh7、SMMC-7721、HCCLM3和HepG2)及人永生化肝細胞LO2均常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37 ℃、含5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱,每2 d更換培養(yǎng)基一次,每4-5 d細胞生長達80%左右時經(jīng)0.25%的胰酶消化傳代.

取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種至6孔板中(接種密度為2×105個/mL),并將細胞分為空白對照組(control,Ctrl)、陰性對照組(si-NC)和轉染組(si-TPT1-AS1).待細胞生長至約70%融合時進行轉染.將si-TPT1-AS1/si-NC和LipofectAMINE2000分別加入到Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻,室溫孵育5 min,然后將已經(jīng)添加si-TPT1-AS1/si-NC的培養(yǎng)基與已經(jīng)添加LipofectAMINE2000分別輕柔混合,室溫繼續(xù)孵育25 min.最后將混合物分別加至預設分組的各組細胞中,置于37 ℃、含5%CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)6 h,更換為完全細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h.檢測轉染效率并進行后續(xù)實驗分析.

1.2.3 劃痕實驗：取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種至6孔板中(預先用記號筆在培養(yǎng)板的背面畫直線作為參考線),接種密度為2×105個/mL.依據(jù)實驗分組轉染si-NC或si-TPT1-AS1后,將細胞板重新置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至細胞生長達到約90%融合.用滅菌槍頭依據(jù)參考線垂直在孔底劃上劃痕,PBS清洗后加入完全細胞培養(yǎng)基繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).分別在0 h和48 h時用倒置相差顯微鏡隨機選取6個視野觀察并采集細胞圖像,檢測劃痕的修復情況并衡量細胞的遷移能力.

1.2.4 Transwell實驗：預先將人工基底膜(Matrigel)基質膠解凍并用無血清的DMEM培養(yǎng)基按1：8的比例稀釋,之后用Matrigel膠均勻包被transwell小室的微孔膜上,37 ℃孵育2 h.用無血清培養(yǎng)基將各組細胞制成1×104個/mL的細胞懸浮液,然后每組細胞取100 μL細胞懸浮液分別接種至transwell小室的上室,在下室中加入700 μL完全細胞培養(yǎng)基,置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h.取出小室后用棉簽輕柔擦除微孔膜上層的細胞,PBS清洗2次后加95%的乙醇固定微孔膜下層的細胞,之后用體積分數(shù)為0.5%的結晶紫染液染色,PBS漂洗后,于倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細胞(每組取6個視野的均值) .

1.2.5 實時熒光定量PCR：依據(jù)Trizol試劑盒說明書所提供的方法抽提組織或細胞總RNA,經(jīng)PrimeScriptTMRT Master Mix kit催化合成cDNA后,采用SYBR-Green PCR Master Mix Kit經(jīng)ABI PRISM 7700系統(tǒng)檢測lncRNA TPT1-AS1的表達.lncRNA TPT1-AS1的正向引物序列為5'-AGGAGGCTATCCTTGCCCATC-3',反向引物序列為5'-AATTGGAGGCCAGTGCTCTGAA-3'；GAPDH作為內參,正向引物序列為5'-GCGACACCCACTCCTCCA CCTTT-3'；反向引物序列為5'-TGCTGTAGCCAAATTCG TTGTCATA-3'.反應參數(shù)設置：95 ℃變性60 sec,45個循環(huán)(94 ℃ 30 sec,62 ℃ 45 sec).結果采用2-△△CT法分析LncRNA TPT1-AS1的相對表達量.

1.2.6 Western blot：各組細胞經(jīng)過相應的處理后,加RIPA裂解液于冰上裂解30 min并用橡膠刮輕柔刮取細胞蛋白.采用BCA蛋白定量試劑盒定量后調整每組上樣蛋白總量至60 μg,加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性后行十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)凝膠電泳.電泳結束后采用200 mA恒流電將蛋白轉移至PVDF膜.用質量分數(shù)為5%的脫脂牛奶室溫封閉膜2 h.依據(jù)各抗體說明書的要求加入一抗4 ℃孵育過夜,洗膜緩沖液(tris-buffered saline with tween 20,TBST)震蕩洗滌5 min×3次；加入對應的二抗室溫孵育2 h,TBST震蕩洗滌10 min×3次,將含蛋白的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜轉移至暗室中利用電化學發(fā)光法顯影,定影并沖洗膠片.所得結果采用Image J行灰度半定量分析.

統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)均錄入SPSS 19.0軟件中行統(tǒng)計學分析.計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,兩組計量資料的統(tǒng)計學差異分析采用t檢驗,多組計量資料間的統(tǒng)計學比較采用方差分析,P＜0.05表示結果有統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1 Linc RNATPT1-AS1在肝癌中的表達 實時熒光定量PCR檢測結果顯示 (圖1A和B),在12例肝癌患者中,相較于配對癌旁正常組織,肝癌組織中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達顯著升高(P=0.036)(圖1A)；在6次獨立細胞實驗中,相較于人永生化肝細胞LO2,肝癌細胞系Huh7、SMMC-7721、HCCLM3和HepG2中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達均出現(xiàn)不同程度的升高(圖1B).

2.2 轉染siRNA-TPT1-AS1對肝癌細胞HepG2侵襲及遷移的影響 轉染效率檢測如圖2A所示,在6次獨立細胞實驗中,轉染siRNA-TPT1-AS1之后HepG2細胞中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達降低至對照組的0.38±0.05倍,可用于后續(xù)實驗.

劃痕實驗的結果如圖2B和D所示,在6次獨立細胞實驗中,Ctrl、si-NC和siRNA-TPT1-AS1組的遷移距離(μm)分別為：156.2±9.31、161.3±10.03和122.6±6.47.同樣,Transwell實驗的結果顯示(圖2C和E),siRNA-TPT1-AS1組HepG2細胞的侵襲率顯著降低至(73.12±5.99)%(P＜0.05).結果顯示siRNA-TPT1-AS1可抑制肝癌細胞HepG2的侵襲及遷移.

2.3 轉染siRNA-TPT1-AS1對HepG2細胞 EMT進程的影響 Western blot的檢測結果如圖3所示,在6次獨立細胞實驗中,轉染siRNA-TPT1-AS1之后,HepG2細胞中上皮細胞標記物E-cadherin的表達顯著增加(P＜0.05),而間質細胞標記物N-cadherin和vimentin的表達明顯減少(P＜0.05).結果顯示siRNA-TPT1-AS1可抑制肝癌細胞HepG2的EMT進程.

2.4 轉染siRNA-TPT1-AS1對PI3K/AKT信號通路活性的影響 本實驗檢測了細胞中PI3K/AKT信號通路的活性,結果顯示(圖4),在6次獨立細胞實驗中,相對于Ctrl組,轉染siRNA-TPT1-AS1后,MMP-9、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05).說明在HepG2細胞中轉染siRNA-TPT1-AS1可明顯抑制PI3K/AKT信號通路的活性以及下游MMP-9的表達.

3 討論

研究表明,lncRNA TPT1-AS1作為一個新的長鏈非編碼RNA,在不同的腫瘤中可通過不同的方式影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展；但其在肝癌中的作用尚不清楚.本實驗通過實時熒光定量PCR初步檢測了肝癌中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達,結果顯示在肝癌組織及肝癌細胞中,lncRNA TPT1-AS1的表達均出現(xiàn)不同程度的升高.這一結果提示,lncRNA TPT1-AS1可能在肝癌進展中發(fā)揮重要作用.

既往研究顯示[9-11]lncRNA TPT1-AS1可影響胃癌、卵巢癌以及結直腸癌等惡性腫瘤的轉移,本實驗通過下調lncRNA TPT1-AS1的表達,系統(tǒng)的研究了其對肝癌細胞HepG2侵襲及遷移能力的影響,并進一步探討了其作用機制.劃痕實驗和Transwell細胞侵襲實驗的結果顯示,轉染siRNA-TPT1-AS1可抑制肝癌細胞HepG2的侵襲及遷移.上皮-間充質轉分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)與腫瘤的侵襲遷移密切相關,如lncRNA TUG1即是通過miR-137/AKT2軸影響肝癌細胞的EMT進程,進而促進肝癌細胞的侵襲及遷移[12].LncRNA HEIH則可通過miR-119a-3p影響肝癌細胞Huh7和Hep3B中vimentin、MMP-2以及MMP-3的表達,進而調控細胞的增殖及遷移[13].我們的研究發(fā)現(xiàn),轉染siRNA-TPT1-AS1之后,HepG2細胞中上皮細胞標志物(E-cadherin)表達升高而間質細胞標記物(N-cadherin,vimentin)的表達則明顯下降,提示下調lncRNA TPT1-AS1可抑制肝癌細胞HepG2的EMT進程.

圖1 肝癌中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達情況.A:肝癌組織和癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達水平，aP＜0.05與癌旁正常組織比較；B:人永生化肝細胞LO2和肝癌細胞系中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達水平，cP＜0.05，dP＜0.01與LO2細胞比較.

圖2 si-TPT1-AS1對HepG2細胞侵襲及遷移的影響.A:轉染效率檢測，aP＜0.05 與對照組A比較；B和D:劃痕實驗檢測HepG2細胞的遷移(放大倍數(shù)100×)，cP＜0.05與對照組B比較；C和E:transwell實驗檢測HepG2細胞的侵襲(放大倍數(shù)200×)，eP＜0.05與對照組C比較.

圖3 si-TPT1-AS1對HepG2細胞EMT進程的影響.aP＜0.05，cP＜0.05，eP＜0.05與對照組比較.

圖4 si-TPT1-AS1對HepG2細胞PI3K/AKT信號通路的影響.aP＜0.05，cP＜0.05，eP＜0.05與對照組比較.

細胞中有多條信號通路可影響腫瘤細胞的EMT進程、遷移與侵襲,其中PI3k/Akt信號通路是一條多功能的經(jīng)典信號通路,PI3K激活后磷酸化并激活AKT,將其定位在質膜中,進而通過AKT將信號傳遞到下游不同的靶點,影響腫瘤細胞的增殖凋亡、侵襲遷移以及分化等生理過程[14,15].Liu等[16]的研究顯示,在結直腸癌中,PI3K/AKT信號通路被激活后可促進核轉錄因子κB(nuclear transcription factor kappa-B,NF-κB)p65的活化及轉位,進而誘導EMT的發(fā)生.在肝癌HepG2和HCCLM3細胞中,PI3K及AKT的磷酸化也是調控細胞EMT進程并影響細胞侵襲遷移的一個重要原因[17].故而本研究檢測了lncRNA TPT1-AS1對PI3K/AKT信號通路的影響,結果發(fā)現(xiàn),轉染siRNA-TPT1-AS1后,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表達水平顯著降低.Zhu等[18]研究表明PI3K/AKT的抑制劑LY294002可抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞中MMP-2與MMP-9的表達.Li等[19]的研究也顯示Bmi-1的過表達通過介導PTEN/PI3k/Akt和上調MMP-2和MMP-9的表達參與了肝細胞癌的轉移和侵襲,提示MMP-2與MMP-9可能受到PI3k/Akt信號通路調節(jié).本實驗的檢測結果也證實在肝癌細胞HepG2中轉染siRNA-TPT1-AS1可抑制MMP-9的表達.以上結果提示下調lncRNA TPT1-AS1可能通過抑制HepG2細胞中PI3K/AKT信號通路的活性以及下游MMP-9的表達,減少胞外基質的降解,進而抑制細胞的EMT進程；但是PI3K/AKT信號通路在其中的具體作用以及是否涉及其他信號通路和靶點還有待進一步深入的研究.

4 結論

綜上所述,lncRNA TPT1-AS1在肝癌組織及細胞中高表達,敲減lncRNA TPT1-AS1可抑制肝癌細胞HepG2的侵襲遷移,其作用機制可能與抑制PI3K/AKT信號通路的活性以及下游MMP-9的表達,進而影響細胞的EMT進程有關.

文章亮點

實驗背景

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肝癌中可發(fā)揮抑癌或促癌作用,其有望成為肝癌診療的新靶點.

實驗動機

LncRNA TPT1-AS1在多種惡性腫瘤中異常高表達,并可促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲.但,TPT1-AS1對肝癌細胞遷移和侵襲的影響尚不清楚.

實驗目標

研究TPT1-AS1對肝癌細胞遷移以及侵襲的影響,以及潛在的機制.

實驗方法

用RT-qPCR檢測肝癌組織與配對的癌旁組織樣本、肝癌細胞系以及肝細胞LO2中l(wèi)ncRNA TPT1-AS1的表達.以HepG2細胞為研究對象,敲除TPT1-AS1后,檢測細胞遷移、侵襲、EMT進程以及PI3K/AKT信號活性.

實驗結果

分別與癌旁組織或肝細胞LO2比較,lncRNA TPT1-AS1在肝癌組織樣本和肝癌細胞系中表達增高.敲除TPT1-AS1后,HepG2細胞的遷移、侵襲、EMT進程以及PI3K/AKT信號活性均降低.

實驗結論

敲除TPT1-AS1能抑制肝癌細胞的遷移、侵襲、EMT進程以及PI3K/AKT信號活性.

展望前景

靶向抑制TPT1-AS1可能是潛在的肝癌的治療策略.