胡立娟，王 豐

腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移是其惡性度高的生物學(xué)標(biāo)志之一，也是腫瘤患者治療失敗和死亡的主要因素[1]。腫瘤細(xì)胞間黏附作用的減弱、細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變、降解以及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、侵襲性增強(qiáng)等有助于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。上皮型鈣黏附蛋白（E-cadherin）表達(dá)下調(diào)與上皮性腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已有研究證實(shí)鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Snail）可下調(diào)E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移[2]。胰腺癌早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移，對(duì)放化療反應(yīng)差，導(dǎo)致5年生存率低于10%[3-4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在包括胰腺癌在內(nèi)的大多數(shù)腫瘤普遍表達(dá)，通過調(diào)控下游100多種靶基因轉(zhuǎn)錄，從增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、能量代謝、血管生成等多方面影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[5-6]。最近研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，重塑細(xì)胞外基質(zhì)及增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲性等機(jī)制促進(jìn)胰腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[7]。

大黃酸是中藥大黃的有效成分，具有抗炎、抗腫瘤等藥理作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)大黃酸能通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK） 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞HIF-1α和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）的表達(dá)[9]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)大黃酸能通過抑制胰腺癌細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)進(jìn)而改善荷瘤小鼠周身代謝紊亂[6,10]，但大黃酸能否通過抑制HIF-1α影響胰腺癌細(xì)胞的遷移尚不清楚。本研究以人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察大黃酸對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，并初步探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞系MiaPaCa-2（#CC 2408）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，胎牛血清（FBS）購自以色列Bioind公司，大黃酸購自美國Sigma公司。CCK8增殖毒性檢測(cè)試劑盒購自北京碧云天公司。Transwell小室購自美國Millipore公司，結(jié)晶紫染色液購自北京索萊寶公司。HIF-1α抗體購自美國Novus公司，E-cadherin抗體和Snail抗體購自美國Abcam公司，β-actin抗體購自美國Sanata Cruz公司，偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體和山羊抗小鼠抗體購自上海良森生物科技有限公司，小鼠抗山羊抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒購于美國Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)大黃酸對(duì)MiaPaCa-2細(xì)胞增殖的影響 用0.25%胰酶將MiaPaCa-2細(xì)胞消化，制成細(xì)胞懸液，每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用無血清DMEM稀釋大黃酸，使其終濃度分別為20、50、100、200 μmol/L，96孔板中每孔加入100 μL稀釋后的大黃酸，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照組加入無血清的DMEM，于常氧（5% CO2、95%空氣、37 ℃）條件下分別孵育24、48、72 h。每孔加入10 μL CCK8溶液，培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上于450 nm處測(cè)定各孔的光密度（OD）值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值）×100%。

1.2.3 Transwell法檢測(cè)大黃酸對(duì)MiaPaCa-2細(xì)胞遷移的影響 本實(shí)驗(yàn)所用Transwell小室孔膜直徑選用的是8 μm。將MiaPaCa-2細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，隨后計(jì)數(shù)，在每個(gè)小室中分別加入5×104個(gè)細(xì)胞，體積為200 μL。與此同時(shí)在Transwell下室中加入含有10% FBS和100 nmol/L胰島素的DMEM培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱2 h后，在上室細(xì)胞中加入2 μmol/L和10 μmol/L的大黃酸，分別置于常氧和缺氧（1% O2、5% CO2、94% N2、37 ℃）條件下，16 h后取出小室做結(jié)晶紫染色。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將小室用PBS洗2遍，用棉簽慢慢擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，將小室放在甲醇中固定15 min，取出小室在室溫下翻轉(zhuǎn)晾干，用0.1%的結(jié)晶紫染液染色10～20 min，PBS洗2遍。把小室底朝上，用正置顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。選取8個(gè)連續(xù)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。將每個(gè)視野中遷移過來的細(xì)胞數(shù)取平均值，即為1次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)大黃酸對(duì)HIF-1α、E-cadherin和Snail表達(dá)的影響 用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配制大黃酸，使其終濃度分別為20、50、100、200 μmol/L，于常氧和缺氧條件下處理細(xì)胞6 h，裂解細(xì)胞，收集蛋白。取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，Western blot法檢測(cè)HIF-1α、E-cadherin和Snail的表達(dá)。一抗孵育過夜，二抗孵育2 h，以β-actin作為內(nèi)參，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物試劑盒檢測(cè)曝光，應(yīng)用NIH Image J 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 大黃酸對(duì)MiaPaCa-2細(xì)胞增殖的抑制作用不同濃度的大黃酸均能有效抑制MiaPaCa-2細(xì)胞的增殖，且抑制作用隨著大黃酸濃度的升高和作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)，呈現(xiàn)出劑量依賴性和時(shí)間依賴性（P＜0.05），見表1。

表1 大黃酸對(duì)MiaPaCa-2細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 大黃酸對(duì)MiaPaCa-2細(xì)胞遷移的影響 在常氧條件下，對(duì)照組細(xì)胞遷移的數(shù)目為（63.20±7.98）個(gè)，2 μmol/L大黃酸作用16 h后，遷移的細(xì)胞數(shù)目約為（35.40±5.59）個(gè)，10μmol/L大黃酸組遷移的細(xì)胞數(shù)目約為（15.20±1.92）個(gè)，與對(duì)照組相比，大黃酸組胰腺癌細(xì)胞遷移數(shù)目減少（P＜0.05）；在缺氧條件下，與對(duì)照組（69.60±9.61）個(gè)相比，2μmol/L大黃酸組和10μmol/L大黃酸組細(xì)胞遷移數(shù)目[分別為（33.80±7.26）個(gè)和（13.20±3.42）個(gè)]減少（P＜0.05）。說明大黃酸抑制胰腺癌細(xì)胞遷移，高濃度大黃酸組抑制細(xì)胞遷移的作用更明顯，見圖1。

圖1 大黃酸對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響

2.3 大黃酸對(duì)MiaPaCa-2 細(xì)胞HIF-1α、E-cadherin和Snail表達(dá)的影響 在常氧狀態(tài)下，HIF-1α表達(dá)很低，缺氧條件下，HIF-1α表達(dá)明顯升高，大黃酸抑制了缺氧條件下，HIF-1α的表達(dá)，且抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng)（P＜0.05）；在常氧和缺氧狀態(tài)下，大黃酸均能抑制Snail的蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)（P＜0.05），且具有劑量依賴性（圖2）。

圖2 大黃酸對(duì)HIF-1α、E-cadherin和Snail表達(dá)的影響

3 討論

大黃酸具有抗腫瘤的生物學(xué)作用，可通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、凋亡、能量代謝等多個(gè)生物學(xué)過程來控制腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，大黃酸和表皮生長因子抑制劑聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡[12]。我們之前的研究表明大黃酸能下調(diào)腫瘤的瓦博格效應(yīng)，從而緩解荷瘤小鼠的周身代謝紊亂[6,10]。本研究結(jié)果顯示大黃酸在體外能直接抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，并且隨著濃度增加和作用時(shí)間的延長，其抑制作用更明顯，說明大黃酸對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用具有劑量和時(shí)間依賴性。

原發(fā)性惡性腫瘤中HIF-1α表達(dá)升高，而轉(zhuǎn)移性腫瘤中HIF-1α的表達(dá)更高，這提示HIF-1α在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移方面起著非常重要的作用[13]。E-cadherin是一種鈣依賴性細(xì)胞黏附分子，可介導(dǎo)細(xì)胞間的連接，其表達(dá)的缺失可使細(xì)胞之間的極性丟失，黏附能力下降。研究發(fā)現(xiàn)43%的人胰腺癌組織中E-cadherin的表達(dá)部分或完全缺失，其表達(dá)的減少或缺失與胰腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān)[14]。Snail可以與E-cadherin啟動(dòng)子上的作用元件相結(jié)合而抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從原發(fā)部位脫落而遷移[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)在低分化的人胰腺癌細(xì)胞株MiaPaCa-2和Panc-1中，Snail的表達(dá)明顯高于分化程度高的細(xì)胞株AsPC-1，Snail在人胰腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)程度與癌細(xì)胞的淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[17]。還有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可通過上調(diào)Snail進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。大黃酸能否通過HIF-1α抑制胰腺癌的遷移尚不清楚。本研究在不影響胰腺癌細(xì)胞增殖的前提下，選用低濃度（2 μmol/L和10μmol/L）大黃酸觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示在常氧和缺氧條件下大黃酸均能抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移。同時(shí)Western blot結(jié)果顯示大黃酸抑制了HIF-1α和Snail的表達(dá)，而上調(diào)了E-cadherin的表達(dá)，且隨著大黃酸濃度增加，作用越明顯，表明大黃酸通過抑制HIF-1α和Snail的表達(dá)，繼而上調(diào)了E-cadherin的表達(dá)，抑制胰腺癌細(xì)胞遷移。

綜上所述，大黃酸能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，其作用機(jī)制可能是通過抑制HIF-1α實(shí)現(xiàn)的。深入闡明大黃酸抗胰腺癌的作用機(jī)制將有助于臨床治療腫瘤新藥的研發(fā)。