王德好 丁曉慶 劉軍霞 郭明 廖俊堯 李玲 諶海燕

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一種骨髓造血功能衰竭綜合征，可發(fā)生于各年齡組，臨床以血三系減少為主要表現(xiàn)，其實質(zhì)是T淋巴細(xì)胞異?；罨?、功能亢進(jìn)造成骨髓損傷[1]。其中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)/輔助性T細(xì)胞17(helper T type 17,Th17)細(xì)胞的免疫失衡是AA發(fā)病的重要機(jī)制之一[2-3]。課題組前期使用科室經(jīng)驗方再障膏方聯(lián)合環(huán)孢素治療AA顯示出良好的臨床效果，而進(jìn)一步的動物實驗也證實了再障膏方聯(lián)合環(huán)孢素能明顯改善AA模型小鼠外周血及Treg/Th17細(xì)胞失衡狀態(tài)[4]。我們將前期實驗小鼠的脾臟進(jìn)行分析，使用蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測各組叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein 3,FOXP3)、GATA結(jié)合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA-3)、T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor T-bet,T-bet)及Notch1蛋白表達(dá)水平，分析其變化及與Treg/Th17細(xì)胞變化的關(guān)系，以期為AA的臨床治療及進(jìn)一步研究提供方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

近交系SPF級BABL/c小鼠，雌性56只，8～12周齡，18～22 g。購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號SCXK(京)2016-0010。

1.2 主要藥品及試劑

白消安(粉末)為上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品。環(huán)孢素軟膠囊為杭州中美華東制藥有限公司產(chǎn)品；再障膏方由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院制劑室統(tǒng)一濃煎呈膏狀，藥劑室進(jìn)行藥材質(zhì)量控制(主要成分為炙黃芪30 g、黨參15 g、白術(shù)15 g、陳皮15 g、茯苓15 g、川芎15 g、當(dāng)歸15 g、白芍15 g、生地黃15 g、丹參30 g、杜仲15 g、續(xù)斷15 g、桑寄生15 g、龜板膠10 g、鹿角膠10 g、女貞子15 g、墨旱蓮15 g)。PE-Cy5標(biāo)記的CD3單克隆抗體、FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體、PE標(biāo)記的CD25單克隆抗體、BV421標(biāo)記的RORyt抗體、FcR阻斷劑(CD16/32)均為美國BD Pharmigen公司產(chǎn)品。APC標(biāo)記的FOXP3抗體、FOXP3染色緩沖組為美國eBioscience公司產(chǎn)品。Ant-T-bet、Ant-GATA-3、Ant-FOXP3、Ant-Notch1為美國Abcam公司產(chǎn)品。Ant-GAPDH為北京天德悅生物科技責(zé)任有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

高端分析流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(美國BIO-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)；ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BIO-Rad公司)；低溫離心機(jī)(德國Sigma公司)。

1.4 藥物給藥劑量及配備

正?；颊呤褂脛┝浚涸僬细喾剑阂惶靸纱慰诜?，一次1袋(16 g)；CsA：200 mg/天；參照徐叔云等[5]主編的《藥理實驗方法學(xué)》以及陳奇[6]《中藥藥理研究方法學(xué)》，按人與動物間體表面積折算的等效劑量比值表計算，小鼠給藥劑量=成人給藥劑量/388。給藥劑量為：再障膏方：82 mg/天；CsA：0.5 mg/天。

白消安溶液：用無菌注射用水配置為4 mg/mL的均勻混懸液，分裝在-20℃保存(下同)；再障膏方溶液：820 mg/mL；環(huán)孢素溶液：5 mg/mL。

1.5 模型建立

選取56只BALB/c小鼠，隨機(jī)分為空白組8只，實驗組48只。將實驗組按照36 mg/kg劑量白消安灌胃，連續(xù)給藥5天(課題組前期研究表明該給藥劑量、時間能形成較穩(wěn)定的AA模型)，同時給空白組予以等量的無菌注射用水。

待模型組動物造模成功后，再次按隨機(jī)數(shù)字表法分為：模型組18只，中藥組、西藥組、中+西藥組，每組10只，治療周期為10天。其中空白組、模型組使用無菌注射用水0.1 mL、2次/天灌胃，中藥組及西藥組分別使用再障膏方溶液0.1 mL(早)、CsA溶液0.1 mL(晚)灌胃，無菌注射用水0.1 mL分別于晚、早灌胃，中+西藥組使用再障膏方溶液0.1 mL(早)、CsA溶液0.1 mL(晚)灌胃。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血Treg、Th17細(xì)胞

在200 μL抗凝全血中加入FCR阻斷劑，避光孵育15分鐘，加入PE-Cy5標(biāo)記的CD3單抗、FITC標(biāo)記的CD4單抗、PE標(biāo)記的CD25單抗各1 μg，避光孵育30分鐘，裂解紅細(xì)胞，離心、棄上清(共2次)，加入新鮮制備的Fixation/Permeabilization Buffer應(yīng)用液，避光孵育12分鐘，最后加入APC標(biāo)記的FOXP3抗體和BV421標(biāo)記的RORyt抗體各1 μg，4℃避光孵育30分鐘，1小時內(nèi)上機(jī)即可。結(jié)果分析應(yīng)用Cell Quest軟件。

1.7 WB法檢測小鼠脾臟FOXP3、GATA-3、T-bet、Notch1蛋白表達(dá)

取小鼠脾臟組織研碎，裂解液提取蛋白，BCA法蛋白定量，后加入緩沖液，沸水浴5分鐘使蛋白變性。每孔取20 μg蛋白上樣進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育，最后放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠外周血Treg/Th17細(xì)胞比例變化

模型組Treg/Th17比例與空白組相比明顯下降(P<0.01)；西藥組、中+西藥組與模型組相比，Treg/Th17比例明顯上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而中藥組和模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1、圖1。

2.2 各組小鼠脾臟FOXP3蛋白表達(dá)水平

模型組FOXP3蛋白表達(dá)低于空白組(P<0.05)。西藥組、中+西藥組與模型組相比，F(xiàn)OXP3蛋白表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但西藥組與中+西藥組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；單純中藥組與模型組相比亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1、圖1。

2.3 各組小鼠脾臟GATA-3蛋白表達(dá)水平

模型組GATA-3蛋白表達(dá)低于空白組(P<0.05)。中藥組、西藥組、中+西藥組與模型組相比，GATA-3蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，中+西藥組的GATA-3蛋白表達(dá)水平最高(P<0.01)，明顯高于單純中藥組、西藥組。進(jìn)一步說明中西藥聯(lián)合運(yùn)用有明顯的協(xié)同作用。見表1、圖1。

2.4 各組小鼠脾臟T-bet蛋白表達(dá)水平

模型組T-bet蛋白表達(dá)高于空白組(P<0.05)。與模型組相比，中藥組、西藥組、中+西藥組T-bet蛋白表達(dá)均顯著下降，其中西藥組最明顯(P<0.01)，中+西藥組次之，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

2.5 各組小鼠脾臟Notch1蛋白表達(dá)水平

模型組Notch1蛋白表達(dá)明顯低于空白組(P<0.01)。中藥組、中+西藥組與模型組相比，Notch1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而中藥組與中+西藥組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。西藥組與模型組相比較亦無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組小鼠脾臟FOXP3、GATA-3、T-bet、Notch1蛋白電泳條帶圖比較

表1 各組小鼠目標(biāo)蛋白表達(dá)水平

3 討論

再生障礙性貧血在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬于“虛勞”“髓枯”等范疇。中醫(yī)多認(rèn)為虛勞主要與脾腎虧虛相關(guān)，脾為后天之本，主運(yùn)化水谷精微，為氣血生化之源，脾虛則血生化無源。腎為先天之本，主骨生髓，腎虛則髓無以生。我們臨床應(yīng)用再障膏方治療再生障礙性貧血顯示出良好的效果，該方主要以八珍湯為底方，方中炙黃芪、黨參、白術(shù)、陳皮、茯苓健脾益氣，何首烏、熟地黃、菟絲子、龜板膠、鹿角膠、女貞子、續(xù)斷、杜仲、肉蓯蓉、桑寄生、墨旱蓮、當(dāng)歸補(bǔ)腎養(yǎng)血，兼以川芎、丹參活血化瘀，以防過于滋補(bǔ)阻礙氣血運(yùn)行。全方共奏培補(bǔ)脾腎、補(bǔ)氣養(yǎng)血之功。目前西醫(yī)治療AA存在傳統(tǒng)藥物毒副作用大、療效限制，新興生物制劑遠(yuǎn)期療效不確定、價格昂貴等缺點，而中藥由于具有多作用靶點、增效減毒的特點，在AA的治療上具有一定的優(yōu)勢，聯(lián)合西藥治療可在一定程度上減輕或解除免疫損傷因素，促進(jìn)、恢復(fù)骨髓造血功能[7]。本研究結(jié)果顯示AA模型小鼠外周血Treg/Th17比例降低，脾臟FOXP3、GATA-3、Notch1蛋白下降、T-bet蛋白上升，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致，證實AA發(fā)生與免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān)。

FOXP3僅存在于Treg細(xì)胞表面，Treg細(xì)胞為具有免疫抑制功能，為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的一種，對于調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能及免疫穩(wěn)定具有重要作用[8]。研究表明，自身免疫性疾病的發(fā)生與FOXP3基因的缺失或表達(dá)水平的失調(diào)有關(guān)，而自身免疫性疾病患者多有FOXP3蛋白水平的變化[9]。同時，F(xiàn)OXP3蛋白的主要作用途徑在于介導(dǎo)Treg/Th17的失衡，從而參與多種疾病的進(jìn)展。目前的研究表明，F(xiàn)OXP3的表達(dá)及功能的發(fā)揮涉及多種環(huán)節(jié)及通路的調(diào)控，關(guān)于如何通過調(diào)控FOXP3的表達(dá)與修飾也成為治療免疫相關(guān)疾病的新靶點[10]。本研究結(jié)果表明，相對于模型組，單純中藥對AA小鼠脾臟FOXP3表達(dá)無影響，單純西藥及中西藥聯(lián)合都可以明顯增加FOXP3表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

T-bet和GATA-3是人體重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)Th1和Th2類細(xì)胞因子表達(dá)水平。GATA-3是1993年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，廣泛表達(dá)于造血組織、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、乳腺等組織[11]，參與Th2細(xì)胞分化調(diào)節(jié)，可以通過調(diào)節(jié)甲基化的方式，間接影響相關(guān)因子的組蛋白修飾功能，進(jìn)而促使相關(guān)因子的表達(dá)[12]。同時，還能直接與多種基因的啟動子結(jié)合參與相關(guān)因子的表達(dá)調(diào)控，如HSVa、CGRE、HSII、及白介素-13等基因，該基因主要調(diào)控Th2相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向Th2方向轉(zhuǎn)化[13]。也能抑制Th1相關(guān)基因(如T-bet)的轉(zhuǎn)錄，阻止相關(guān)因子及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞向Th1方向的轉(zhuǎn)化。有研究顯示，AA患者的GATA-3的水平顯著降低，并且降低程度與疾病活動程度及免疫異常水平有關(guān)[14]。T-bet是轉(zhuǎn)錄因子T-box家族成員之一，在骨髓、臍血祖細(xì)胞及干細(xì)胞在內(nèi)的血細(xì)胞中都有表達(dá)[15]，主要為CD4+T細(xì)胞，是Th1重要的轉(zhuǎn)錄因子，可誘導(dǎo)初始型CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生大量干擾素-γ，進(jìn)而促進(jìn)Th1細(xì)胞極化(GATA-3抑制干擾素-γ產(chǎn)生)，也可促進(jìn)白介素-12R的產(chǎn)生，進(jìn)而誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的分化[16]。

T-bet與GATA-3相互協(xié)調(diào)，通過對自身及其他細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，組成完整的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，通過對Th1、Th2及其他亞群的調(diào)節(jié)分化，進(jìn)而達(dá)到調(diào)整免疫功能穩(wěn)定的作用[11]。研究表明，T-bet與GATA-3表達(dá)異常導(dǎo)致的Th1/Th2比例失衡，可以導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，如腫瘤[17]、免疫相關(guān)性疾病等。本研究結(jié)果表明，相對于模型組，單純中藥、西藥、中+西藥組GATA-3表達(dá)均上升、T-bet表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中結(jié)合用藥組在使GATA-3表達(dá)水平升高上具有顯著的協(xié)同作用(P<0.01)。而T-bet表達(dá)在西藥組中下降最明顯(P<0.01)，中+西藥組次之(P<0.05)。Notch受體有4種，廣泛分布于干細(xì)胞、原始細(xì)胞及免疫細(xì)胞表面。Notch信號通路可以同時調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的分化，主要是促進(jìn)T細(xì)胞、抑制B細(xì)胞的分化[18]。而Jagged1-Notch1信號可誘導(dǎo)CD4+T向Th2及Treg細(xì)胞的分化。也有研究表明Notch1通過直接作用于T-bet啟動子的形式促進(jìn)Th1的分化。多種血液疾病均與Notch信號通路的異常有關(guān)，AA的發(fā)生也被證明與該通路的關(guān)系密切，有可能是通過T-bet下調(diào)Notch1方式影響，而GATA-3是Notch信號通路的下游必要的因子之一。另外也有報道表明AA小鼠的Treg/Th17平衡與Notch信號通路的變化存在明顯相關(guān)性,認(rèn)為該信號通路可能是導(dǎo)致AA發(fā)生的主要因素[19]。本研究結(jié)果表明，相對于模型組，單純中藥、中西藥聯(lián)合治療均能明顯增加Notch1蛋白表達(dá)(P<0.05)，而單純西藥組治療無差異。

綜上所述，再障膏方聯(lián)合環(huán)孢素能顯著改善AA模型小鼠脾臟FOXP3、GATA-3、T-bet、Notch1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)外周血Treg/Th17細(xì)胞比例恢復(fù)平衡，二者變化趨勢有一定的相似性。由此說明健脾補(bǔ)腎中藥能促進(jìn)環(huán)孢素的免疫調(diào)節(jié)作用，推測其作用機(jī)理可能與激活Notch1信號通路有關(guān)，但仍需后期進(jìn)一步實驗來證實。