史博文，李蘊(yùn)哲，杜 研，宋 寧

（1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安710061；2.西安國際醫(yī)學(xué)中心麻醉手術(shù)中心，陜西 西安710075）

鹽酸雷尼替丁又名呋喃硝胺，是一種選擇性H2受體拮抗劑，臨床上常用于治療消化性潰瘍、急性上消化道出血、反流性食管炎和胃泌素瘤等［1］。鹽酸雷尼替丁還經(jīng)常與維生素C聯(lián)合治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍［2］，與咪唑斯汀聯(lián)合治療慢性特發(fā)性蕁麻疹［3］。

溶菌酶是一種小分子堿性蛋白質(zhì)，由130 個(gè)氨基酸殘基組成［4］。它廣泛存在于鳥類、家禽的蛋清中和哺乳動(dòng)物的淚液、唾液、血漿和乳汁中［5］，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫等藥理作用。溶菌酶是藥物發(fā)揮藥效的一種重要載體，常作為模型蛋白用于研究藥物小分子與蛋白質(zhì)的相互作用，為研究藥物在體內(nèi)的分布、代謝、藥效的發(fā)揮等提供依據(jù)［6-8］。目前，曹團(tuán)武等［9］對(duì)鹽酸雷尼替丁與牛血清白蛋白之間相互作用進(jìn)行了研究，而其與溶菌酶之間的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。

光譜法因其靈敏度高、選擇性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)成為小分子物質(zhì)與蛋白（酶）相互作用的主要研究手段［10-11］。本研究采用熒光光譜法研究鹽酸雷尼替丁與溶菌酶的作用，重點(diǎn)觀察二者相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)，利用同步熒光光譜法、紫外光譜法、三維熒光光譜等研究其對(duì)溶菌酶構(gòu)象的影響，并應(yīng)用分子對(duì)接模擬鹽酸雷尼替丁與溶菌酶之間可能存在的作用形式，為闡明鹽酸雷尼替丁在體內(nèi)的分布和代謝過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

鹽酸雷尼替?。ㄖ袊幤肥称费芯吭海眉状既芙獠⑴渲瞥?.85 mmol·L-1的儲(chǔ)備液；溶菌酶（分析純，北京索寶萊科技有限公司），用Tris-HCl 緩沖液溶解并配制成1.0 μmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；Tris-HCl 緩沖液（pH 7.4，含0.1 mol·L-1NaCl 維持溶液的離子強(qiáng)度）；所有儲(chǔ)備液均于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

RF-5301pc 型熒光分光光度計(jì)、UV-2450 型紫外分光光度計(jì)和AY210 分析天平（日本島津公司）；1810b 型超純水機(jī)（上海摩勒生物科技有限公司）；XW-80A 旋混合器（上海馳唐電子有限公司）；DF-101 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

使用Stern-Volmer 曲線方程［12］式①分析鹽酸雷尼替丁與溶菌酶相互作用的猝滅機(jī)制：

式①中，F(xiàn)0：熒光強(qiáng)度（不加猝滅劑）；F：熒光強(qiáng)度（加入猝滅劑）；Kq：雙分子表觀猝滅常數(shù)；τ0：無猝滅劑條件下，熒光分子的平均壽命（約為10-8s）；Ksv：猝滅速率常數(shù)；［Q］：猝滅劑濃度。

根據(jù)不同溫度下Ksv的變化可以判斷猝滅類型。若Ksv隨溫度的升高而增大，則說明猝滅過程為動(dòng)態(tài)猝滅；若Ksv隨溫度的升高而減小，說明猝滅過程為靜態(tài)猝滅。同時(shí)，雙分子表觀猝滅常數(shù)Kq的最大值為2×1010L·mol-1·s-1，若Kq值遠(yuǎn)大于該極限值，則說明猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。

對(duì)于靜態(tài)猝滅，其結(jié)合常數(shù)K 和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n可使用方程式②，式③，式④進(jìn)行計(jì)算［13］：

式②中，K：溫度為T時(shí)的結(jié)合常數(shù)；n：結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

利用Van't Hoff 方程［14］分析鹽酸雷尼替丁與溶菌酶之間的作用力類型：

式③和④中，K：溫度為T 時(shí)的結(jié)合常數(shù)；ΔH：反應(yīng)焓變；R：普適氣體常量；T：絕對(duì)溫度；ΔS：反應(yīng)熵變；ΔG：反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)摩爾吉布斯自由能變。

小分子藥物與蛋白（酶）的作用力類型可以根據(jù)ΔH 和ΔS 的值來判斷：若ΔH＞0，ΔS＞0，則是典型的疏水作用力；若ΔH＜0，ΔS＞0，則是靜電作用力；若ΔH＜0，ΔS＜0，則表明是氫鍵和范德華力；若ΔG＜0，則表明反應(yīng)過程是自發(fā)進(jìn)行的。

根據(jù)F?rster 非輻射能量轉(zhuǎn)移理論［15］，小分子物質(zhì)與熒光發(fā)射基團(tuán)間的能量轉(zhuǎn)移效率（E）和結(jié)合距離（r）可通過式⑤計(jì)算得出：

式⑤中，R0：轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離；R0可由式⑥計(jì)算得出：

式⑥中，K2：偶極空間取向因子；N：介質(zhì)折射指數(shù)；Φ：供能體的熒光量子產(chǎn)率；J：供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊積分；J 可由式⑦計(jì)算得出：

式⑦中，F(xiàn)（λ）：供能體在波長λ 處的熒光強(qiáng)度；ε（λ）：受能體在波長λ 處的摩爾吸光系數(shù)；Φ：供能體的熒光量子產(chǎn)率；J：供能體的熒光發(fā)射光譜和受能體的紫外吸收光譜的重疊積分。

由文獻(xiàn)［16］可知，K2=2/3，溶菌酶的N=1.40，Φ=0.15［17］。當(dāng)供能體與受能體間的距離足夠接近，r＜7 nm 時(shí)，則說明小分子藥物與蛋白（酶）之間發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。

通過同步熒光法判斷蛋白（酶）生色團(tuán)附近微環(huán)境的變化。當(dāng)Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm 時(shí)，相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)的改變分別反映的是酪氨酸和色氨酸殘基所處微環(huán)境的改變情況［18］。若蛋白（酶）中酪氨酸和色氨酸殘基的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生紅移，說明氨基酸殘基所在的環(huán)境極性增加，肽鏈的伸展程度增加；若發(fā)生藍(lán)移則剛好相反。

1.3 熒光猝滅光譜法測定鹽酸雷尼替丁和溶菌酶的結(jié)合類型

在25℃（298 K），30℃（303 K）和37℃（310 K）溫度下，精密量取10 mL溶菌酶1.0 μmol·L-1儲(chǔ)備液于試管中，逐次加入鹽酸雷尼替丁儲(chǔ)備液，每次2 μL，渦旋，恒溫水浴5 min。狹縫寬度為5 nm，激發(fā)波長（λex）設(shè)為282 nm，在290～410 nm 范圍內(nèi)掃描熒光光譜，記錄最大發(fā)射波長（λem）處熒光強(qiáng)度變化。

1.4 能量轉(zhuǎn)移法測定鹽酸雷尼替丁和溶菌酶的結(jié)合距離

精密量取10 mL 溶菌酶1.0 μmol·L-1儲(chǔ)備液于試管中，于25℃恒溫水浴5 min，于熒光光譜儀上測定發(fā)射光譜，獲得溶菌酶溶液在290～400 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜。

另精密量取10 mL Tris-HCl（pH 7.4）緩沖溶液于離心管中，然后加入一定量的鹽酸雷尼替丁溶液，使得藥物濃度等于溶菌酶儲(chǔ)備液的濃度，于紫外光譜上記錄290～400 nm的紫外吸收光譜。

1.5 同步熒光光譜法測定溶菌酶中酪氨酸和色氨酸殘基微環(huán)境

室溫下，操作方法同1.3。以Δλ=15 nm和Δλ=60 nm 測定其同步熒光光譜，檢測加藥前后酪氨酸和色氨酸殘基熒光峰位的變化。

1.6 紫外吸收光譜法測定溶菌酶結(jié)構(gòu)

精密量取10 mL 溶菌酶1.0 μmol·L-1儲(chǔ)備液于試管中，逐次加入鹽酸雷尼替丁儲(chǔ)備溶，每次2 μL，渦旋，25℃反應(yīng)5 min，在200～400 nm 范圍內(nèi)掃描溶菌酶-鹽酸雷尼替丁體系的紫外光譜，檢測加藥前后溶菌酶特征紫外吸收峰的強(qiáng)度和位置的改變。

1.7 三維熒光光譜法測定溶菌酶結(jié)構(gòu)

精密量取10 mL 溶菌酶1.0 μmol·L-1儲(chǔ)備液于試管中，于25℃恒溫水浴5 min，于熒光光譜儀上測定其220～500 nm 范圍內(nèi)的三維熒光光譜。將初始λex設(shè)為220 nm，隨后每增加2 nm 測定1 次λem，直至λex設(shè)置為400 nm。

另精密量取10 mL 溶菌酶1.0 μmol·L-1儲(chǔ)備液于試管中，于25℃恒溫水浴5 min，然后加入一定量的鹽酸雷尼替丁溶液至離心管中，使得藥物濃度等于溶菌酶儲(chǔ)備液的濃度，恒溫反應(yīng)5 min后，同法測定溶菌酶-鹽酸雷尼替丁體系的三維熒光光譜，檢測加藥前后溶菌酶三維熒光特征峰的強(qiáng)度和位置的改變。

1.8 分子對(duì)接法模擬鹽酸雷尼替丁與溶菌酶的結(jié)合

利用Molecular Operating Environment（MOE）軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬，模擬小分子與溶菌酶的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合后的可能構(gòu)象。鹽酸雷尼替丁的分子結(jié)構(gòu)從Chemical Book 中下載Mol 文件，溶菌酶的晶體結(jié)構(gòu)（PDB 編碼為4D9Z）從RCSB 下載。模擬前去除溶菌酶三維晶體結(jié)構(gòu)中的水分子、離子及與小配體藥物無關(guān)的其他雜配體，然后將優(yōu)化后的溶菌酶晶體結(jié)構(gòu)和雷尼替丁在MOE 中進(jìn)行分子對(duì)接，獲得最可能的結(jié)合構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸雷尼替丁對(duì)溶菌酶熒光猝滅機(jī)制的分析

在熒光猝滅光譜中，鹽酸雷尼替丁在25，30 和37℃下均可使溶菌酶的熒光產(chǎn)生猝滅。當(dāng)向試管中不斷加入鹽酸雷尼替丁，使其濃度不斷增加時(shí)，溶菌酶的熒光強(qiáng)度降低。由此可推測，鹽酸雷尼替丁與溶菌酶發(fā)生了相互作用。圖1為鹽酸雷尼替丁在25，30及37℃時(shí)對(duì)溶菌酶熒光的影響。

鹽酸雷尼替丁的猝滅曲線如圖2 所示，其線性方程及相關(guān)參數(shù)見表1。據(jù)表1 可知，鹽酸雷尼替丁與溶菌酶相互作用的Ksv隨溫度升高而增大，初步判斷其猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅，但是由于雙分子表觀猝滅常數(shù)Kq值遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，說明其引起溶菌酶熒光猝滅的主要原因是形成了復(fù)合物，即其猝滅機(jī)制以靜態(tài)猝滅為主，動(dòng)態(tài)猝滅仍占有一定比例。

2.2 鹽酸雷尼替丁和溶菌酶的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

Fig.1 Fluorescence quenching spectra of lysozyme（Lys）by ranitidine hydrochloride at 25℃（298 K，A），30℃（303 K，B）and 37℃（310 K，C）. 1-11：the concentra?tion of ranitidine hydrochloride was 0，0.57，1.14，1.71，2.28，2.85，3.14，3.99，4.56，5.13 and 5.70 μmol·L-1，respectively.

Fig.2 Stern-Volmer plots for fluorescence quenching of Lys by ranitidine hydrochloride at different tempera?tures. F：fluorescence intensity（quencher presence）；F0：fluorscence intensity（quencher absence）；[Q]：concentration of quencher.

鹽酸雷尼替丁對(duì)溶菌酶作用的雙對(duì)數(shù)曲線圖（圖3）所示，其結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)見表2。由表2 可知，在25℃時(shí)，鹽酸雷尼替丁的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為0.72，表明其在25℃下與溶菌酶可能通過一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合。而在30 和37℃時(shí)其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n 約為0.5，推測1 個(gè)溶菌酶可與2 個(gè)藥物小分子結(jié)合。同時(shí)，鹽酸雷尼替丁的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均隨著溫度的升高而減小，說明溫度升高可能會(huì)破壞藥物與溶菌酶形成配合物的穩(wěn)定性，進(jìn)一步說明其作用機(jī)制為靜態(tài)猝滅。

Tab.1 Stern-Volmer equation and parameters for ranitidine hydrochloride binding to Lys

Fig.3 Plots of lg［（F0-F）/F］against lg［Q］for binding constant of Lys.

Tab.2 Binding constants and binding sites for raniti?dine hydrochloride binding to Lys

2.3 鹽酸雷尼替丁與溶菌酶的主要作用力類型

以lnK 對(duì)1/T做線性回歸，由直線的斜率和截距即可得到鹽酸雷尼替丁與溶菌酶結(jié)合過程的焓變?chǔ)為-177.25 kJ·mol-1、熵變?chǔ)為-540.97 J·mol-1·K-1及鹽酸雷尼替丁在25，30 和37℃下與溶菌酶相互作用，標(biāo)準(zhǔn)摩爾吉布斯自由能變?chǔ) 分別為-16.05，-13.34 和-9.55 kJ·mol-1。ΔG＜0 說明其相互作用過程是自發(fā)進(jìn)行的；ΔH＜0，ΔS＜0 說明其與溶菌酶主要作用力類型為氫鍵和范德力。

2.4 鹽酸雷尼替丁與溶菌酶的結(jié)合距離

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，溶菌酶熒光發(fā)射光譜與鹽酸雷尼替丁溶液的紫外吸收光譜之間具有重疊（圖4）。根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算可知，溶菌酶與鹽酸雷尼替丁的能量轉(zhuǎn)移效率E=0.87，重疊積分J=5.59×10-15cm3·L·mol-1，r=1.63 nm（＜7 nm），表明蛋白與藥物之間發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移。

Fig.4 Overlap of fluorescence spectra of Lys and absorp?tion spectrum of ranitidine hydrochloride. The concen?tration of Lys and ranitidine hydrochloride was both 1.0 μmol·L-1.UV：ultraviolet spectroscopy；FLU：fluorescence spectroscopy.

2.5 鹽酸雷尼替丁對(duì)溶菌酶色氨酸和酪氨酸殘基微環(huán)境的影響

圖5 表示在室溫條件下，鹽酸雷尼替丁與溶菌酶在Δλ=15 nm（酪氨酸殘基）和Δλ=60 nm（色氨酸殘基）時(shí)相互作用的同步熒光光譜。結(jié)果顯示，隨著鹽酸雷尼替丁濃度的增加，酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度降低，在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm時(shí)峰位未發(fā)生明顯改變，表明色氨酸和酪氨酸殘基所處的微環(huán)境未發(fā)生明顯變化。

2.6 鹽酸雷尼替丁對(duì)溶菌酶芳香族氨基酸微環(huán)境的影響

紫外吸收光譜結(jié)果表明（圖6），溶菌酶在280 nm附近有最大吸收，隨著鹽酸雷尼替丁濃度的增加，溶菌酶的吸光度依次增加，表明溶菌酶與鹽酸雷尼替丁相互作用，并且由于這種相互作用，溶菌酶與鹽酸雷尼替丁之間形成了基態(tài)復(fù)合物，進(jìn)一步說明其與溶菌酶發(fā)生熒光猝滅的作用機(jī)制為靜態(tài)猝滅。同時(shí)，鹽酸雷尼替丁對(duì)溶菌酶的紫外吸收光譜在280 nm 附近發(fā)生明顯的紅移，表明芳香族氨基酸的微環(huán)境親水性增強(qiáng)。

2.7 鹽酸雷尼替丁對(duì)溶菌酶肽鏈骨架的影響

Fig.5 Effect of ranitidine hydrochloride on synchro?nous fluorescence spectra of Lys at Δλ=15 nm（A）and Δλ=60 nm（B）. The concentration of Lys was 1.0 μmol·L-1；1-11：concentration of ranitidine hydrochloride was 0，0.57，1.14，1.71，2.28，2.85，3.14，3.99，4.56，5.13 and 5.70 μmol·L-1，respectively.

Fig.6 Effect of ranitidine hydrochloride on ultraviolet spectrum of Lys. 1-11：The concentration of ranitidine hydro?chloride was 0，0.57，1.14，1.71，2.28，2.85，3.14，3.99，4.56，5.13 and 5.70 μmol·L-1，respectively.

三維熒光結(jié)果顯示（圖7，表3），在室溫下加入鹽酸雷尼替丁后，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光特征峰A 及溶菌酶肽鏈骨架的特征吸收峰峰B的強(qiáng)度均降低，表明鹽酸雷尼替丁對(duì)溶菌酶肽鏈骨架有影響。

Fig.7 3D fluorescence spectra of Lys in absence（A）and presence（B）of ranitidine hydrochloride. The concen?trations of Lys and ranitidine hydrochloride were both 1.0 μmol·L-1.Peak1 and peak2 represent the primary and secondary Rayleigh scattering peaks；peak A represents the characteristic absorp?tion peaks of tyrosine and tryptophan residues；peak B repre?sents the characteristic absorption peaks of the lysozyme peptide chain backbone［19］.ex：excitation；em：emission.

2.8 雷尼替丁與溶菌酶結(jié)合分子對(duì)接

雷尼替丁的分子對(duì)接結(jié)果如圖8 所示，根據(jù)分子模擬對(duì)接結(jié)果可知，雷尼替丁在Ser72 周圍與溶菌酶通過氫鍵進(jìn)行相互作用，并存在2 個(gè)氫鍵。結(jié)合位點(diǎn)周圍的氨基酸殘基有Arg68，Thr69，Asp66，Gly67，Asn65，Ser72，Arg73和Asn74。

Tab.3 3D fluorescence characteristic parameters of Lys in absence and presence of ranitidine hydrochloride

Fig. 8 2D simulation results of molecular docking between ranitidine hydrochloride and Lys.：the hydrogen bond between the acceptor and the ligand，the donor is located at the root of the arrow，and the acceptor is located at the head. The hydrogen bond is formed in the side chain of the residue.

3 討論

本研究運(yùn)用熒光光譜、同步熒光光譜、紫外光譜、F?rster 非輻射能量轉(zhuǎn)移理論、三維熒光光譜及分子對(duì)接研究了鹽酸雷尼替丁與溶菌酶的相互作用。熒光猝滅實(shí)驗(yàn)表明，鹽酸雷尼替丁與溶菌酶的作用機(jī)制為靜態(tài)猝滅，但動(dòng)態(tài)猝滅仍占一定比例。在25℃時(shí)，鹽酸雷尼替丁的n 為0.72，表明其在25℃下與溶菌酶可能通過1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。而在30和37℃時(shí)n約為0.5，可推測1個(gè)溶菌酶可與2個(gè)藥物小分子結(jié)合。同時(shí)，鹽酸雷尼替丁的K 和n 均隨著溫度的升高而減小，說明溫度升高可能會(huì)破壞藥物與溶菌酶形成配合物的穩(wěn)定性，進(jìn)一步說明其作用機(jī)制為靜態(tài)猝滅。溶菌酶與鹽酸雷尼替丁的相互作用是自發(fā)進(jìn)行的，主要作用力類型為氫鍵和范德華力。根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移原理，其與溶菌酶間產(chǎn)生了能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)同步熒光光譜、紫外光譜和三維熒光光譜可知，鹽酸雷尼替丁與溶菌酶結(jié)合時(shí)對(duì)酶的構(gòu)象有影響。分子對(duì)接結(jié)果表明，雷尼替丁與Ser72殘基形成了2個(gè)氫鍵。探討藥物分子與溶菌酶之間的相互作用可為闡明外源藥物在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，有助于藥動(dòng)學(xué)研究。