鄧弘仙，吳利紅，張云惠，范詩逸，黃 玲，蔣海靜，賴 翼，楊淑霞，劉 陽，羅興燕

（成都醫(yī)學院1.藥學院，2.臨床醫(yī)學院，3.檢驗醫(yī)學院，4.科研實驗中心，四川 成都610500）

T 細胞增殖分化是免疫應答的中心環(huán)節(jié)，其異常增殖分化在移植排斥反應［1］、類風濕性關節(jié)炎［2］和系統(tǒng)性紅斑狼瘡［3］等自身免疫性疾病的發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色。而抑制T細胞增殖分化與發(fā)揮生物學功能的免疫抑制劑改變了上述疾病的臨床治療效果，使越來越多患者的病情得到緩解。目前，臨床上已有一些免疫抑制劑可用于治療移植物排斥和自身免疫疾病，它們通過不同機制抑制T 細胞的異常活化和增殖，如環(huán)孢菌素A 和他克莫司抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性［4］，西羅莫司（siroli?mus）抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路［5］。但自身免疫性疾病是一類多因素誘發(fā)、多種細胞參與并涉及多條信號轉(zhuǎn)導通路的復雜疾病。且不同患者的誘發(fā)因素、發(fā)病機制以及對藥物的敏感性，存在顯著個體差異。臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)單一療法效果不明顯時，還需給予聯(lián)合、輪換或序貫治療。因此，繼續(xù)探索疾病的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)更多的治療靶點和全新結(jié)構(gòu)的先導化合物，將為患者帶來更多的選擇與希望。

文獻報道，來源于石蒜科（Amaryllidaceae）網(wǎng)球花蔥蓮〔Zephyranthes candida（Lindl.）Herb.〕的網(wǎng)球花定堿具有十分廣泛的藥理活性，如抗瘧疾［6］、抗癌［7］、抗病毒［8］以及抗有絲分裂［9］等，但其免疫抑制活性研究尚未見報道。本課題組已建立了免疫抑制活性高通量篩選技術平臺，已篩選到一系列具有良好免疫抑制活性的小分子化合物，如BD750［10］和PO-291［11］等。本研究觀察本課題組近期篩選到的氮網(wǎng)球花定堿鹽酸鹽（N-methyl?hemeanthidine hydrochloride，NMHC）對活化T 細胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

NMHC、LY294002（磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）和西羅莫司（純度99%），美國Sigma-Aldrich 公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（批號：50615），澳大利亞Bovogen 公司；抗人CD3/CD28、抗人CD3-APC、抗人CD25-PE-cy單抗及抗人細胞因子白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）（批號：0416AFC12 I1317）、IL-6（批號：0409AFC16 K1915）、IL-17A（批號：1109AFC84 H2013）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）單抗（批號：0215AFC27-J2615），美國eBioscience 公司；羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）（批號：B258747），美國Invitrogen 公司；人外周血淋巴細胞分離液（批號：71769262），挪威AxisShieldPoC 公司；人T 細胞MACS 磁珠分離試劑盒（批號：5170711130），德國Miltenyl Biotec 公司；細胞凋亡檢測試劑盒（批號：20190302）和細胞周期檢測試劑盒（批號：20181108），南京凱基生物公司。Ⅱ級A2型生物安全柜、Sorvall Lengend Micro17 型小型臺式離心機和3111 型5%CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司），AE2000LED 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司），PowerWave XS2 酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Tek公司），Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 人外周血單個核細胞分離和T細胞純化

經(jīng)捐贈者知情同意，靜脈采集其外周血。采用密度梯度離心法［12］分離外周血單個核細胞（periph?eral blood mononuclear cells，PBMC），分離步驟為：①將采集的人外周血與FBS 等比例混合后，傾斜45 度貼壁緩慢加入到已經(jīng)預先加入淋巴細胞分離液的10 mL 玻璃離心管中，外周血、PBS 和人外周血淋巴細胞分離液三者的比例為1∶1∶1，室溫下600×g 離心，20 min。②離心后吸出并收集中間的乳白色單個核細胞層，用1% FBS-RPMI 1640 不完全培養(yǎng)基重懸離心300×g，5 min，重復2 次。③離心后的細胞用10% FBS-RPMI 1640 完全培養(yǎng)基重懸細胞，得到人PBMC。

分離后的PBMC，按照人T 細胞分選試劑盒說明書陰性分選人T細胞［13］。純化步驟為：①用2 mL離心管取分離出的人PBMC，300×g 離心10 min，去上清。②每1×107個細胞使用40 μL試劑盒提供的緩沖液重懸細胞，然后加入10 μL 生物素標記的混合抗體?；靹蚝?～8℃靜置孵育10 min。③孵育結(jié)束后，加入1 mL 緩沖液洗滌后，300×g 離心10 min，去上清。④每1×107個細胞使用30 μL 緩沖液重懸細胞，然后加入20 μL 抗生物素微球?；靹蚝?～8℃靜置孵育15 min。⑤加入1 mL 緩沖液洗滌后，300×g 離心10 min，去上清。使用200 μL緩沖液重懸細胞，備用。⑥將MS 柱安裝在標準磁力架上，使用500 μL 緩沖液潤洗1 次。將備用的200 μL 細胞加入MS 柱，讓細胞自然流出，用2 mL離心管收集細胞。⑦使用緩沖液洗滌MS 柱每次400 μL，3 次，使用同一管2 mL 離心管收集液體。⑧300×g 離心10 min，去上清。加入10% FBSRPMI 1640 的完全培養(yǎng)基1 mL 重懸細胞，并取樣檢測細胞純度。⑨抗人CD3-APC 染色純化前后的細胞，流式細胞儀檢測T 細胞純度，T 細胞純度＞95%用于后續(xù)實驗。

1.3 流式細胞術檢測靜息T細胞存活率

實驗前將NMHC 溶于DMSO，濃度為40 mmol·L-1，分裝保存于-80℃冰箱。臨用前用10% FBS-RPMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋藥物。

純化后的靜息T細胞（1×109L-1）接種于96孔板中，每孔1×105細胞。細胞分為細胞對照組及NMHC 0.5，2和8 μmol·L-1組。細胞對照組加含0.1%DMSO的10% FBS-RPMI 1640 完全培養(yǎng)基，NMHC 組加入不同濃度的NMHC，每孔體積共200 μL。每組設3 復孔，共培養(yǎng)96 h后，采用PI（1 mg·L-1）染色。結(jié)合流式細胞術［14］檢測活細胞（PI-）數(shù)量（number，N），計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（NNMHC組/N細胞對照組）×100%。實驗重復2次。

1.4 流式細胞術檢測活化T細胞增殖率

用0.1% PBS-BSA 溶液調(diào)整靜息T 細胞密度為1×109L-1，加入CFSE 濃度至2.5 μmol·L-1，37℃水浴鍋中孵育15 min。染色結(jié)束后，離心洗滌2次，最后加入10% FBS-RPMI 1640 完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為2×109L-1。T 細胞活化［15］步驟為：①提前12 h 預先包被抗人CD3 單抗（2.5 mg·L-1）于96 孔培養(yǎng)板表面，每孔50 μL；②去除包被液，用PBS 清洗1次，再加入純化后標記了CFSE的靜息T細胞（每孔100 μL）和抗人CD28 抗體（0.625 mg·L-1，每孔50 μL），孵育96 h，使細胞活化增殖。

細胞分組：雙抗未刺激組（靜息T細胞接種于不含抗CD3/28 抗體的96 孔板中）、雙抗刺激組（靜息T 細胞經(jīng)抗CD3/28 抗體刺激，同1.4）及雙抗刺激+NMHC（0.125，0.5，2 和8 μmol·L-1）組（靜息T 細胞加入到抗CD3 抗體包被的96 孔細胞板中，加入抗CD28 抗體和不同濃度NMHC），均于含0.1%DMSO 的10% FBS-RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔1×105細胞，培養(yǎng)體系為200 μL。培養(yǎng)96 h 后按1.3檢測活細胞數(shù)量（N），計算藥物的抑制率。藥物抑制率（%）=（N雙抗刺激+NMHC組-N雙抗未刺激組）/（N雙抗刺激組-N雙抗未刺激組）×100%。每組設3復孔，實驗重復2次。

1.5 流式細胞術檢測CD25表達

純化后的靜息T 細胞（1×109L-1）接種于96 孔板中，每孔1×105細胞。細胞分組：雙抗未刺激組和雙抗刺激組，處理同1.4；雙抗刺激+NMHC 或LY294002 組為抗CD3/CD28 抗體刺激的T 細胞與不同濃度的NMHC（0.5，2 和8 μmol·L-1）或LY294002（50 μmol·L-1）作用，培養(yǎng)體系為200 μL。每組設3 復孔。48 h 后收集各組細胞，加入抗CD25-APC 對T 細胞避光染色30 min，流式細胞儀檢測T細胞表面CD25表達。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期

純化后的靜息T 細胞（1×109L-1）接種于96 孔板中，每孔1×105細胞。細胞分組：雙抗未刺激組和雙抗刺激組，處理同1.4；雙抗刺激+NMHC 或西羅莫司組為抗CD3/CD28 抗體刺激的T 細胞與不同濃度的NMHC（0.5，2 和8 μmol·L-1）或西羅莫司（0.1 μmol·L-1）作用，培養(yǎng)體系為200 μL。每組設3 復孔。培養(yǎng)72 h 后，收集細胞用70%預冷乙醇500 μL 固定，4℃過夜。染色前先離心去除固定液，每管加入RNA 酶：PI=1∶9 的染色工作液500 μL，室溫避光30～60 min 后用流式細胞儀測定細胞周期G0/G1，G2和M期的百分比［16］。實驗重復3次。

1.7 ELISA檢測上清液中IL-2，IL-6，IL-17A和IFN-γ水平

純化后的靜息T 細胞（1×109L-1）接種于96 孔板中，每孔1×105細胞。細胞分組：雙抗未刺激組和雙抗刺激組，處理同1.4；雙抗刺激+NMHC 或LY294002組為抗CD3/CD28抗體刺激的T細胞與不同濃度的NMHC（0.5，2 和8 μmol·L-1）或LY294002（50 μmol·L-1）作用。各組培養(yǎng)24或48 h后，收集上清，用ELISA 試劑盒檢測24 h 上清中IL-2 水平和48 h上清中IL-6，IL-17A和IFN-γ水平［16］。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 分選T細胞純度鑒定

采用密度梯度離心法分離出人外周血中PBMC，分離后的PBMC 按人T 細胞分選試劑盒陰性分選人T 細胞，流式細胞術檢測T 細胞純度。結(jié)果（圖1）顯示，分選前T 細胞純度為58.1%，分選后≥95%，可用于后續(xù)實驗。

Fig.1 Purity of resting T cells examined by flow cytometry before and after sorting. A：human periph?eral mononuclear cells（PBMCs）isolated from peripheral blood by Lymphoprep；B：PBMCs sorted by using the naive pan T cell isolation kit.

2.2 NMHC對靜息T細胞存活的影響

結(jié)果（圖2）顯示，與細胞對照組相比，NMHC 0.5，2 和8 μmol·L-1組細胞存活率分別為（102±6）%，（104±5）%和（100±4）%，表明NMHC對靜息T細胞均無明顯的細胞毒性。

Fig.2 Cytotoxicity of N-methylhemeanthidine hydro?chloride（NMHC）on naive T cells. Naive T cells were treated with NMHC 0.5，2 and 8 μmol·L-1 for 96 h. Cell viability was measured by flow cytometry.±s，n=3.

2.3 NMHC對活化T細胞增殖的影響

如圖3 所示，雙抗刺激+NMHC 0.125 μmol·L-1組活化T細胞增殖率與雙抗刺激組相近，雙抗刺激+NMHC 0.5，2和8 μmol·L-1組隨NMHC 濃度增加逐漸降低，其中8 μmol·L-1組與雙抗未刺激組相近，表明NMHC 顯著抑制抗人CD3/CD28 活化的T 細胞增殖，其IC50為（0.28±0.06）μmol·L-1。

Fig.3 Effect of NMHC on proliferation of activated T cells detected by flow cytometry. The CFSE-labeled T cells were treated with or without NMHC 0.125，0.5，2 and 8 μmol·L-1 and stimulated with or without anti-human-CD3/CD28 mAbs for 96 h，then measured by flow cytometry.B was the quantitative analysis result of A.±s，n=3.

2.4 NMHC對活化T細胞CD25表達的影響

如圖4 所示，藥物與活化T 細胞作用48 h，與雙抗刺激組比較，雙抗刺激+LY294002 組活化T 細胞CD25 表 達 被 顯 著 抑 制（P＜0.05），雙 抗 刺 激+NMHC 0.5 μmol·L-1組CD25 表達無明顯變化，雙抗刺激+NMHC 2和8 μmol·L-1組CD25+細胞百分率明顯降低（P＜0.05）。因此，NMHC 2和8 μmol·L-1可顯著抑制T細胞活化。

2.5 NMHC對活化T細胞周期的影響

Fig.4 Effect of NMHC on CD25 expression of activated T cells detected by flow cytometry. T cells were treated with NMHC 0.5，2 and 8 μmol·L-1 or LY294002 50 μmol·L-1 and activated with or without anti-human-CD3/CD28 mAbs for 48 h. B was the quantitative analysis result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with T cells activated by anti-CD3/CD28 mAbs without drug group.

Fig.5 Effect of NMHC on cell cycles of activated T cells detected by flow cytometry. T cells were treated with NMHC 0.5，2 and 8 μmol·L-1 or sirolimus（Sir）0.1 μmol·L-1 and activated with or without anti-human-CD3/CD28 mAbs for 72 h.B was the quan?titative analysis result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with T cells activated by anti-CD3/CD28 mAbs without drug group.

細胞周期檢測結(jié)果（圖5）表明，NMHC 與活化T 細胞作用72 h，對細胞周期的影響與免疫抑制劑西羅莫司相似。NMHC 2 和8 μmol·L-1時，G0/G1期細胞百分比明顯增加（P＜0.05），S 期細胞百分比減少（P＜0.05），表明NMHC 可抑制細胞內(nèi)DNA合成，阻滯活化T細胞周期于G0/G1期，從而抑制活化T細胞增殖。

2.6 NMHC對活化T細胞分泌細胞因子水平的影響

圖6 所示，與雙抗刺激組相比，雙抗刺激＋NMHC 0.5，2 和8 μmol·L-1組促炎因子IL-2，IL-6，IFN-γ 和IL-17A 水平明顯降低（P＜0.05），表明NMHC 對促炎細胞因子IL-2，IL-6，IFN-γ 和IL-17A的分泌具有顯著抑制作用。

Fig.6 Effect of NMHC on cytokine production in activated T cells detected by ELISA. T cells were treated with NMHC 0.5，2 and 8 μmol·L-1 or LY294002 50 μmol·L-1 and activated with anti-human-CD3/CD28 mAbs for 24 or 48 h. ±s，n=3. ＊P＜0.05，compared with T cells activated by anti-CD3/CD28 mAbs without drug group.

3 討論

NMHC 是一種新型的石蒜科生物堿［18］，可通過激活NOTCH 信號通路抑制急性髓系白血病細胞增殖［19］，或通過下調(diào)蛋白激酶B 活化抑制胰腺癌細胞增殖。但其對活化T細胞的作用尚未見報道。

靜息T 細胞受抗CD3 和CD28 抗體共刺激后，通過激活鈣調(diào)磷酸酶、絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB信號通路，引起活化T 細胞核因子、激活蛋白1 和NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子的活化?；罨霓D(zhuǎn)錄因子啟動下游基因表達，如IL-2和CD25。IL-2與CD25結(jié)合后激活下游JAK3-STAT5通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白-核糖體S6 蛋白激酶等信號通路，向細胞內(nèi)傳遞增殖信號，從而啟動細胞周期，使T細胞增殖［21］。本研究結(jié)果表明，NMHC 對T 細胞活化具有顯著抑制作用，其IC50為（0.28±0.04）μmol·L-1，濃度達8 μmol·L-1時對人靜息T 細胞無明顯的細胞毒性。CD25 表達和IL-2 分泌是T細胞活化的標志［22］。NMHC可抑制活化T細胞CD25 的表達和IL-2 的分泌，表明NMHC 主要作用于T 細胞的活化階段。同時，NMHC 還將細胞周期阻滯于G0/G1期，表明NMHC 作用機制可能與阻斷T細胞活化階段的關鍵信號通路有關。

活化T 細胞可分化為輔助性T 細胞（helper T cell，Th）1，Th2，Th17 和Treg 細胞，細胞因子是參與免疫調(diào)節(jié)的信號分子，主要由Th 細胞產(chǎn)生［23］。但如果免疫系統(tǒng)被侵襲引起體液中多種促炎細胞因子大量分泌，會出現(xiàn)“細胞因子風暴”，危及患者生命［24］。本研究結(jié)果顯示，NMHC 顯著抑制促炎細胞因子IL-6，IL-17A 和IFN-γ 的分泌，表明NMHC抑制T 細胞增殖的同時，可抑制其促炎細胞因子的分泌。

綜上所述，NMHC 主要通過抑制CD25 表達和IL-2 分泌、阻滯細胞周期于G0/G1期，進而選擇性地抑制活化T 細胞增殖。現(xiàn)有的免疫抑制劑中，環(huán)孢素和他克莫司通過選擇性抑制T細胞活化發(fā)揮免疫抑制作用［24］，已在臨床上用于治療異體器官或骨髓移植的排異反應、類風濕性關節(jié)炎和重癥肌無力等免疫性疾病。由此提示，NMHC 有可能成為潛在的免疫抑制先導化合物，但待進一步探索。