梅花鹿的馴養(yǎng)、人工繁殖已有數(shù)百年歷史，2020年5月梅花鹿進(jìn)入了《國家畜禽遺傳資源目錄》。鹿茸是梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載鹿茸具有壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任、托瘡毒的作用。其中調(diào)沖任、托瘡毒是指調(diào)理周身氣血，促進(jìn)局部血流，有利于創(chuàng)傷愈合[2]。近年鹿茸藥用研究集中在對心腦血管系統(tǒng)保護(hù)、促進(jìn)生殖系統(tǒng)發(fā)育、修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)以及抗疲勞、抗衰老等方面[3～6]，而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合相關(guān)研究較少。皮膚創(chuàng)傷恢復(fù)包括出血期、炎性期、增殖期和重塑期，此過程中有多種細(xì)胞及因子參與反應(yīng)[7]。創(chuàng)傷愈合取決于新生毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞生長和分化，較多的新生毛細(xì)血管可改善創(chuàng)面組織供氧，加速創(chuàng)面的基礎(chǔ)代謝，促進(jìn)修復(fù)[8]。成纖維細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)愈合，而成纖維細(xì)胞合成的膠原纖維則是胞外基質(zhì)的主要成分[9]。其中膠原蛋白是膠原纖維的主要成分，羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征氨基酸[10]，其含量可反映創(chuàng)傷組織的愈合程度。

超微粉碎技術(shù)指利用沖擊、碰撞、剪切、研磨、分散、分級、表面包覆等機(jī)械加工手段，將物料粉碎至微米級的加工技術(shù)[11]，已在中藥加工業(yè)中廣泛應(yīng)用。動物藥材的有效成分主要在細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間質(zhì)，且以胞內(nèi)為主[12]。超微粉碎在完全破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，可增大動物藥材表面積比及孔隙率，增加水溶性蛋白含量溶出度，增大溶出速率[13]，利于有效成分吸收，因此更適用于動物藥材加工。

鹿茸微粉對創(chuàng)傷組織的修復(fù)具有積極作用，如促進(jìn)傷口愈合、抑制瘢痕組織形成等[14，15]。但關(guān)于微粉粒度對促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合是否有影響尚不明確。為此，本研究將超微粉碎技術(shù)應(yīng)用于鹿茸加工中，通過比較不同粒度鹿茸微粉對小鼠皮膚創(chuàng)傷組織的修復(fù)效果，以明確藥用鹿茸微粉的最佳粒徑，為進(jìn)一步研發(fā)鹿茸外敷類藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物昆明小鼠90只，雄性，體重（20±3）g，SPF級，在三級動物室無菌飼料喂養(yǎng)。小鼠、飼料均購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 試劑與儀器材料與試劑：梅花鹿茸（山西省藥物培植廠）、脫毛膏、碘酒、酒精、戊巴比妥鈉、凡士林、硬脂酸、羊毛脂、苯甲酸鈉、甘油、伊紅、二甲苯、石蠟、甲醛、小鼠羥脯氨酸試劑盒（上海酶聯(lián)生物有限公司）。

儀器：全自動酶免生化分析儀CHIMWE290（美國AWARENES 公司）；低溫高速離心機(jī)SC-3614（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)HSS7320型（沈陽恒松科技有限公司）；振動式超微粉碎機(jī)WZJ-6B（濟(jì)南日方機(jī)械有限公司）；Mastersizer 2000 激光粒徑分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

圖1 不同粉碎時(shí)間鹿茸微粉粒徑特征值D90、D50

1.3.1 鹿茸超微粉的制備和選擇 取梅花鹿茸飲片3 000g 將其粗粉，而后平均分成30份。在冷卻水26℃條件下，每份100g 鹿茸粗粉用超微粉碎機(jī)分別加工3、4、5、6、7、8、9、10、11、12min，粉碎試驗(yàn)重復(fù)3次。用激光粒度儀測定不同粉碎時(shí)間鹿茸微粉的粒徑特征值D90、D50，見圖1。局部外敷所用散劑需為藥典規(guī)定的“最細(xì)粉”，即需要全部微粉通過六號篩、95%的微粉通過七號篩。故可用于試驗(yàn)的鹿茸微粉散劑粉碎時(shí)間應(yīng)大于6min，而超微粉碎11min 之后，鹿茸微粉粒度的變化率較小。結(jié)合能耗綜合考慮，取粉碎時(shí)間為7、8、9、11min 鹿茸微粉為本次試驗(yàn)材料。粉碎時(shí)間7min的微粉為粗粉、8min 為中粉、9min 為細(xì)粉、11min 為超細(xì)粉。本研究粗粉符合藥典中最細(xì)粉規(guī)定，而中粉、細(xì)粉、超細(xì)粉均符合藥典中極細(xì)粉規(guī)定。

1.3.2 創(chuàng)傷模型的制作 取90 只昆明小鼠，用脫毛膏脫去小鼠背部毛發(fā)，溫水清洗擦干，用1%水合氯醛（1g/100ml）按35mg/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉。而后用5%碘酒和75%酒精局部消毒，于小鼠后背脊柱兩側(cè)對稱位置10mm 處剪開直徑為10mm 的圓形傷口各1個(gè)，深度至皮下，不傷及筋膜及脂肪組織。肌層傷口厚度約3mm，用生理鹽水沖洗傷口、消毒。開放創(chuàng)面，充分止血，待清醒后單籠飼養(yǎng)觀察24h，期間自由飲水與進(jìn)食。以傷口無淤血、腫脹、化膿，小鼠取食正常、活動能力好為判斷標(biāo)準(zhǔn)，共選取72只小鼠入組試驗(yàn)。

1.3.3 分組及給藥方式 小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只，組間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。第1組為模型對照組，每日敷無菌淀粉100mg，不作其他治療[16]，第2～5組依次使用粗粉、中粉、細(xì)粉、超細(xì)粉治療，第6組為莫匹羅星軟膏陽性對照組。入組后共飼養(yǎng)14d，各組每日用碘酒和生理鹽水消毒。第2～6組每日敷藥1次，每只小鼠共給藥100mg。用無菌棉簽均勻涂抹各傷口后以無菌紗布包扎防止藥粉抖落，單只小鼠各傷口敷藥均為50mg。

1.3.4 體重記錄和創(chuàng)面觀察 每日對創(chuàng)面變化進(jìn)行觀察并拍照記錄，著重觀察個(gè)體精神狀態(tài)、創(chuàng)面變化、肉芽組織生長及愈合情況等，如出血、滲出、皺縮、紅腫、結(jié)痂等。每隔3d 對所有小鼠進(jìn)行稱重，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.5 創(chuàng)面愈合率 各組給藥前用消毒的半透明稱量紙貼于創(chuàng)面，沿創(chuàng)緣描出輪廓，用CAD 軟件計(jì)算所繪面積，作為創(chuàng)口原始面積。敷藥第7、14天，同法可直接得到未愈合的創(chuàng)面面積，以此計(jì)算愈合率[17]。愈合率=（創(chuàng)面原始面積-未愈合的創(chuàng)面面積）/創(chuàng)面原始面積×100%。

1.3.6 小鼠免疫器官臟器指數(shù) 給藥14d后，脊椎脫臼處死小鼠，及時(shí)取出小鼠的胸腺、脾臟，生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干水分，稱重，按公式計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)：I=W1/W0，I 為胸腺指數(shù)或脾臟指數(shù)，W1為胸腺或脾臟重量（g），W0為小鼠體重（g）[18，19]。

1.3.7 創(chuàng)面新生肉芽組織羥脯氨酸的測定 處死小鼠后立即取創(chuàng)面新生肉芽組織，按重量體積比1∶10加生理鹽水并制成組織勻漿。而后3 000r/min 離心10min 取上清液，再按1∶4 加生理鹽水稀釋成2%的組織勻漿，-80℃保存?zhèn)溆?。然后?.3ml 組織上清液，按照試劑盒說明檢測羥脯氨酸含量。

1.3.8 組織學(xué)觀察 處死小鼠后取創(chuàng)面新生皮膚，標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定24h，酒精梯度脫水，二甲苯脫脂透明，浸蠟過夜，需石蠟定向包埋，切片6μm 厚，脫蠟復(fù)水后常規(guī)HE染色，中性樹膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察創(chuàng)面組織并拍照。

2 結(jié)果

2.1 體重變化各組小鼠體重均呈先降低后升高的趨勢，第1～4天各組小鼠體重均有所下降，可能是由于創(chuàng)傷影響了小鼠進(jìn)食。第4～14天各組小鼠體重均逐漸上升，組間體重變化無明顯差異（P>0.05）。見表1。14d 給藥過程中無個(gè)體死亡，且不同粒度微粉散劑對小鼠整體無明顯影響，說明模型安全可靠。

2.2 創(chuàng)面觀察第1組在第7天和第14天時(shí)，創(chuàng)面邊緣均有輕微發(fā)炎、紅腫現(xiàn)象，較其他試驗(yàn)組愈合速度慢；各給藥組在第7天創(chuàng)面均已經(jīng)結(jié)痂，第5組痂皮略薄。各給藥組在第7、14天時(shí)均未出現(xiàn)紅腫、出血等現(xiàn)象。

2.3 創(chuàng)面愈合率第7天，與第1組相比，第5、6組創(chuàng)面愈合率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。第14天，與第1組相比，第3、4、5、6組創(chuàng)面愈合率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表1 各組小鼠體重變化（g）

表2 各組第7、14天創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）

表2 各組第7、14天創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）

注：與第1組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別 第7天 第14天第1組 68.7259±0.1029 90.9664±0.0256第2組 74.5068±0.1330 93.1132±0.0105第3組 78.3580±0.0713 94.0215±0.0194*第4 組 79.3867±0.0675 94.6361±0.0203**第5組 81.1001±0.0645* 95.0617±0.0221**第6組 87.8893±0.0431** 95.4186±0.0105**

2.4 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)第4、6組胸腺指數(shù)顯著高于第1組（P<0.05），說明鹿茸細(xì)粉和莫匹羅星可以促進(jìn)小鼠的胸腺生長，見表3。

2.5 創(chuàng)面新生肉芽組織羥脯氨酸含量第4、6組創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量顯著高于第1組，說明細(xì)粉組和陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織中膠原蛋白合成量高于模型對照組，創(chuàng)面愈合較快，見圖2。

表3 各組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)

圖2 各組小鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量測定結(jié)果

2.6 組織學(xué)觀察低倍鏡下，HE染色后細(xì)胞核呈暗紅色，而毛囊、毛細(xì)血管、表皮層呈深紅色。各組新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞已形成。第1組表皮層薄、毛囊較少且分化程度低，新生毛細(xì)血管稀疏；第2組表皮層顏色較深、毛囊稍密集且分化程度低，新生毛細(xì)血管稍多；第3組表皮層稍厚、毛囊稍多且分化程度較高，新生毛細(xì)血管稀疏；第4 組表皮層明顯加厚、毛囊密集且分化程度較高，大部分毛囊已呈梭型，新生毛細(xì)血管密集且分化程度高；第5組表皮層略厚、毛囊密集且分化程度較高，大部分毛囊已呈梭型并突出表皮層，新生毛細(xì)血管密集且分化程度高；第6組表皮層略厚、毛囊密集且分化程度較高，大部分毛囊已呈梭型并突出表皮層，新生毛細(xì)血管密集且分化程度高，見圖3。高倍鏡下，第1組表皮層與真皮層連接不緊密，成纖維細(xì)胞分布稀疏；第2組表皮層與真皮層連接緊密，成纖維細(xì)胞分布稀疏；第3組表皮層與真皮層連接緊密，成纖維細(xì)胞分布較密集；第4、5、6組表皮層與真皮層連接緊密，成纖維細(xì)胞分布密集。與第1組比較，第3、4、5組新生創(chuàng)面組織表皮較厚，且與真皮層連接緊密，毛囊和新生毛細(xì)血管較多，分化程度高，成纖維細(xì)胞分布密集，見圖4。

圖3 新生皮膚HE染色結(jié)果（×100）

圖4 新 生皮膚HE染色結(jié)果（×200）

3 討論

近年來，超微粉碎技術(shù)在中藥散劑中的應(yīng)用日趨增多，可將傳統(tǒng)粉碎工藝得到的中心粒徑為150～200 目（75μm 以下）的粉末，加工到5～10μm 以下[20]，而在該粒度下，一般藥材細(xì)胞的破壁率為95%，有效成分可完全暴露出來，利于藥材成分溶出，起效更加迅速。同時(shí)整個(gè)粉碎過程在密閉狀態(tài)下進(jìn)行，減少了藥物被微生物污染的機(jī)會。

鹿茸是傳統(tǒng)的名貴中藥，梅花鹿的鹿茸中水溶性蛋白質(zhì)含量為50%～60%，降解后可獲得多種活性多肽。其中多種單體鹿茸多肽或生長因子具有促進(jìn)缺損創(chuàng)傷皮膚愈合作用[21]，如鹿茸多肽[22]、表皮生長因子[23]、轉(zhuǎn)化生長因子[24]等。由于鹿茸多肽、生長因子本身不穩(wěn)定，經(jīng)口進(jìn)入機(jī)體內(nèi)降解速度較快，所以本研究采用散劑外敷。微粉粒度直接影響鹿茸水溶性蛋白的溶出度、釋放速度、藥物起效時(shí)間、生物利用度。近年超微粉碎技術(shù)工藝不斷升級，粉碎過程中原料營養(yǎng)損失較小，表面積比增大，有效成分能迅速、充分地溶出，利于人體吸收[25]。

目前，用于治療皮膚創(chuàng)傷的藥物主要為抗生素類藥物，如百多邦、皮炎平、紅霉素軟膏等，中藥則相對較少?？股仡愃幬餀C(jī)制主要是消炎殺菌，抑制膿皰病、癤腫、毛囊炎等原發(fā)性皮膚感染，對創(chuàng)面愈合無直接促進(jìn)作用。而本研究顯示，細(xì)粉可以促進(jìn)膠原蛋白合成，提升小鼠個(gè)體免疫力。創(chuàng)面愈合率方面，中粉、細(xì)粉、超細(xì)粉均顯著加快修復(fù)創(chuàng)面皮膚速度。從組織學(xué)方面分析，中粉、細(xì)粉、超細(xì)粉均可促進(jìn)毛細(xì)血管再生及細(xì)胞分化，使表皮層厚度恢復(fù)。綜合考慮，細(xì)粉效果最為理想，可能由于細(xì)粉易于吸收，活性成分在加工中保存較好，因此提高了小鼠的免疫力，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。粗粉、中粉粒度較大，粉碎不徹底不利于小分子功效成分吸收而效果有限。本研究使用的超微粉碎設(shè)備為振動式粉碎設(shè)備，較長的粉碎時(shí)間可使超細(xì)粉在加工過程中因瞬時(shí)產(chǎn)熱過多導(dǎo)致功效成分損失。

本研究運(yùn)用超微粉碎技術(shù)加工鹿茸飲片，通過控制粉碎時(shí)間得到不同粒徑鹿茸微粉。設(shè)計(jì)皮膚缺損創(chuàng)面模型，以外用藥效果為依據(jù)得出了最佳粒徑，其特征值D50 為26.729μm、D90 為48.532μm，為鹿茸相關(guān)散劑外用藥品開發(fā)提供了理論依據(jù)。